【摘要】：目的：粘著斑激酶(focal adhesion kinase; FAK)是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶(non-receptor protein tyrosine kinase),對(duì)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。最近有研究顯示,FAK也存在于興奮性谷氨酸能突觸、并參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)。然而,FAK在脊髓中樞敏感化過(guò)程中的作用仍然不清楚。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2; ERK1/2)和N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate; NMDA)型谷氨酸受體的活性與痛覺(jué)敏化密切相關(guān)。本研究的目的,在于探討FAK對(duì)脊髓背角ERK1/2的活性及NMDA受體介導(dǎo)的痛覺(jué)突觸傳遞的調(diào)控作用。方法：本研究通過(guò)小鼠后足底皮下注射完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant;CFA)來(lái)創(chuàng)建疼痛模型,再通過(guò)免疫蛋白印跡、行為學(xué)測(cè)試、膜片鉗電生理學(xué)記錄、免疫組織化學(xué)等方法來(lái)探討外周炎性損傷對(duì)脊髓背角FAK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用及其意義。結(jié)果：(1)免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示：FAK表達(dá)于痛覺(jué)調(diào)控的關(guān)鍵部位---脊髓背角神經(jīng)元中；(2)足底注射CFA后,脊髓背角FAK的第397位酪氨酸殘基(FAK-Tyr397)的磷酸化水平會(huì)顯著增加,提示：慢性炎性疼痛的形成伴隨有脊髓FAK的活化；(3)鞘內(nèi)給予NMDA受體拮抗劑D-APV (5μg)、或Ⅰ型代謝型谷氨酸受體(Group I Metabotropic glutamate receptor; Group I mGluR)拮抗劑AIDA (25μg),均能有效降低炎性疼痛小鼠FAK-Tyr397的磷酸化水平,提示：外周組織損傷可能通過(guò)激動(dòng)脊髓NMDA受體和Ⅰ型mGluR受體,誘導(dǎo)FAK的活化；(4)為直接觀察FAK在中樞敏感化中的作用,本研究在脊髓背角過(guò)表達(dá)野生型FAK[FAK(WT)],發(fā)現(xiàn)：即使在正常小鼠,FAK(WT)也可誘發(fā)明顯的熱痛覺(jué)過(guò)敏和機(jī)械性痛覺(jué)超敏,而過(guò)表達(dá)無(wú)活性的FAK突變體--FAK(Y397F),則對(duì)正常小鼠的痛行為不會(huì)產(chǎn)生任何影響；(5)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：FAK(WT)的一個(gè)重要作用,在于激活脊髓背角ERK1/2、顯著提高ERK1/2的磷酸化水平；鞘內(nèi)注射MEK抑制劑U-0126 (0.2μg、0.5μg和1.0 μg),能夠劑量依賴性地緩解FAK(WT)誘發(fā)的疼痛癥狀,提示：FAK可能通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路,參與中樞敏感化的形成；(6) FAK(WT)激活的ERK1/2,能夠提高NMDA受體GluN2B、GluN1亞基在突觸小體膜結(jié)構(gòu)(synaptosomal membrane fraction; P3)中的表達(dá),而對(duì)P3中NMDA受體G1uN2A亞基、以及α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑型谷氨酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid; AMPA)受體GluAl亞基的表達(dá)卻沒(méi)有明顯影響；(7)CFA顯著提高脊髓背角ERK1/2的磷酸化水平,而這一作用可被FAK(Y397F)所逆轉(zhuǎn)；(8)電生理學(xué)記錄顯示：將抗FAK的特異性抗體通過(guò)記錄電極導(dǎo)入炎性疼痛小鼠脊髓背角Ⅱ板層神經(jīng)元后,NMDA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流(Excitatory postsynaptic currents; EPSCs)幅值會(huì)顯著降低,而非特異性的IgG卻無(wú)此作用；(9)行為學(xué)結(jié)果顯示：脊髓背角表達(dá)FAK(Y397F)、抑制內(nèi)源性FAK的活性,能夠有效緩解CFA誘發(fā)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏。結(jié)論：FAK可能通過(guò)FAK/ERK/GluN2B信號(hào)通路誘發(fā)NMDA受體的功能亢進(jìn),參與脊髓中樞敏感化的形成；直接表達(dá)無(wú)活性的FAK(Y397F)突變體能夠有效緩解慢性炎性疼痛癥狀。
【圖文】：

圖１－１人體ＦＡＫ結(jié)構(gòu)示意圖逡逑ＦＡＫ邋的結(jié)構(gòu)。３］包含了一個(gè)邋Ｎ－末端的邋ＦＥ民Ｍ邋（Ｆｏｕｒ－ｐｏｉｎｔ－０打ｅ，Ｅｚｒｉｎ，民ａｄｋｉｎ，逡逑Ｍｏｅｓｉｎ）結(jié)構(gòu)域、一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域（ｋｉｎａｓｅ邋ｄｏｍａｉｎ）、兩個(gè)脯氨酸富集域（ｐｒｏ邋ｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ逡逑ｄｏｍａｉｎ）、及一個(gè)Ｃ－末端的粘著斑鞭向定位結(jié)構(gòu)域（Ｆｏｃａｌ邋Ａｄｈｅｓｉｏｎ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ逡逑

嘸っ感藕攀怕范約顧璞辰鞘┚跬淮ゴ鄏蕕牡鶻謐饔茫]3?ｄｏｍａｉｎ；邋ＦＡＴ）（圖１－１）邋Ｍ。ＦＥＲＭ結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與生長(zhǎng)因子受體（ｇ的ｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ逡逑ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、整合素（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）等相互作用，將這些膜蛋白感受的細(xì)胞外信號(hào)逡逑向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，在靜息情況下，ＦＥＲＭ結(jié)構(gòu)域會(huì)與激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生分子內(nèi)逡逑的結(jié)合，這種分子折疊導(dǎo)致ＦＡＫ處于無(wú)活性狀態(tài)—旦膜表面的生長(zhǎng)因子受逡逑體、整合素Ｗ及Ｇ蛋白偶聯(lián)受體（Ｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、受體型酪氨酸逡逑激酶（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｔｙｒｏｓｉｎｅ邋ｋｉｎａｓｅｓ）等被激抽邐細(xì)胞內(nèi)的鉤離子濃逡逑度就會(huì)大量增加，同時(shí)蛋白激酶Ｃ邋（Ｐｒｏｔｅｉｎ拉ｎａｓｅＱＰＫＣ）也會(huì)被激活ｆＷ。在逡逑巧離子和／或ＰＫＣ的作用下，ＦＡＫ就會(huì)向細(xì)胞膜定位，使得ＦＥＲＭ結(jié)構(gòu)域與跨膜逡逑蛋白、信號(hào)蛋白等相互結(jié)合；這種結(jié)合，，打斷了邋ＦＥＲＭ結(jié)構(gòu)域?qū)っ附Y(jié)構(gòu)域的逡逑封閉，導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)域的暴露，隨后，ＦＡＫ的第３９７位酪氨酸殘基（Ｔｙｒ３９７）就逡逑會(huì)發(fā)生自身z1酸化
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R402

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本文編號(hào)：2569020