本文選題：金黃色葡萄球菌　切入點：利奈唑胺　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：金黃色葡萄球菌是人體常見致病菌之一,可引起多種嚴(yán)重感染,由于耐藥金黃色葡萄球菌的廣泛流行給臨床治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。利奈唑胺作為第一個應(yīng)用于臨床的VA唑烷類抗陽性菌藥物,被用于各種耐藥金黃色葡萄球菌感染治療,但隨著臨床廣泛應(yīng)用,細(xì)菌對利奈唑胺的快速耐藥引起臨床廣泛關(guān)注。本論文對來自全國縣級醫(yī)院門診分離金黃色葡萄球菌對利奈唑胺的耐藥機(jī)制及其分子基礎(chǔ)進(jìn)行了全面研究,以期對耐藥控制和臨床用藥提供依據(jù)。 第一部分：本研究收集了2010年至2011年全國12個省30家縣級醫(yī)院分離的475株金黃色葡萄球菌,用稀釋法測定這些菌株對青霉素G、苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢呋辛、慶大霉素、環(huán)丙沙星、磷霉素、克林霉素、紅霉素、利奈唑胺、萬古霉素、替考拉寧及四環(huán)素等藥物的MIC值。根據(jù)對利奈唑胺MIC水平的不同,將這些菌株進(jìn)行分組,分別在各組隨機(jī)抽取一定數(shù)量菌株進(jìn)行耐藥機(jī)制研究。應(yīng)用PCR測序法對其中36株菌株篩檢利奈唑胺靶位23S rRNA等位基因(rrn1-rrn6)突變點和利奈唑胺靶位L蛋白(L3,L4,L22)基因突變。對475株金黃色葡萄球菌篩檢cfr基因,對cfr陽性菌株檢測體外藥敏情況和進(jìn)行MLST分子分型,并篩檢利奈唑胺靶位23S rRNA等位基因(rrn1-rrn6)突變點和利奈唑胺靶位L蛋白(L3,L4,L22)基因突變。 體外藥敏試驗結(jié)果顯示,475株菌株對萬古霉素和替考拉寧均敏感,98.7%的菌株對磷霉素敏感,菌株對苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢呋辛、慶大霉素、環(huán)丙沙星的敏感率分別為84.7%,85.9%,87.2%,86.6%,73.2%,78.2%,而對青霉素G,克林霉素,紅霉素的敏感率僅為16.4%,48.7%,32.8%。按照CLSI臨床折點,沒檢出對利奈唑胺耐藥菌株。 根據(jù)細(xì)菌對利奈唑胺的敏感性,將這些菌株分為5組：MIC為0.25、0.5、1、2和4μg/ml組。分別從各組選取1株,4株,10株,10株,11株,共36株菌來作進(jìn)一步研究。經(jīng)PCR和序列比對分析,共有12株菌在23S rRNA等位基因domainV區(qū)分別發(fā)生T2238C,G2398A, C2263T, C2112T, C2129T, C2219T, G2127A, C2234T, G2416A共9種核苷酸突變類型。有8株菌在分別在L3,L4或L22蛋白發(fā)生8個氨基酸突變。對475株金黃色葡萄球菌篩檢出14株cfr陽性菌株,這些菌株利對奈唑胺的MIC為2μg/ml或4μg/ml,對替考拉寧和萬古霉素均敏感,對氯霉素、克林霉素和紅霉素表現(xiàn)較高的耐藥性。經(jīng)PCR和序列比對分析,這14株cfr陽性菌株中有3株在23S rRNA等位基因domain V區(qū)發(fā)生核苷酸突變,5株在L3和L4蛋白發(fā)生氨基酸突變。 對這些突變點分析發(fā)現(xiàn),利奈唑胺MIC為0.5μg/ml時,菌株在23S rRNA domain V和L蛋白均無發(fā)生突變；MIC為1μg/ml的10株菌中有4株菌在23S rRNA domain V發(fā)生核苷酸突變,無L蛋白氨基酸突變；MIC為2μg/ml的16株菌中,6株攜帶有cfr基因,有6株茵在23S rRNA domain V發(fā)生核苷酸突變,4株菌在L蛋白發(fā)生氨基酸突變；MIC升至4μg/ml的11株菌中有8株發(fā)現(xiàn)攜帶有crr基因,3株在23SrRNA domain V發(fā)生核苷酸突變,5株菌在L蛋白氨基酸發(fā)生突變。比較不同MIC組中的突變點和cft"基因發(fā)現(xiàn),隨著對利奈唑胺MIC值的增高,細(xì)菌位于23S rRNA或L蛋白的突變點數(shù)量和類型均增多,這種逐漸遞增的突變點數(shù)量和突變類型可能為菌株由對利奈唑胺敏感變?yōu)榕R床耐藥提供條件。 第二部分：應(yīng)用Southern雜交確定cft"的基因定位,用PCR walking技術(shù)分析cfr基因的周圍基因序列。同時對第一部分篩選出的9個位于細(xì)菌23S rRNA等位基因domain V區(qū)的點突變,應(yīng)用RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件Mfold和RNA三級空間結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件3dRNA分別構(gòu)建23S rRNA domain V區(qū)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),以Pymol軟件對這些空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行突變堿基與藥物空間作用的改變分析。 Southern雜交證實在14株菌株中cfr基因位于質(zhì)粒。對攜帶cfr基因的約5.6kb質(zhì)粒片段進(jìn)行測序,結(jié)果顯示cfr基因上游是一個IS256插入序列,下游緊鄰的是一個orf1基因然后是一個IS256插入序列。經(jīng)序列比對分析,發(fā)現(xiàn)本研究的質(zhì)粒片段與1株來自中國動物源科氏葡萄球菌中攜帶cfr基因的質(zhì)粒pSS-01在序列上有99%同源性。另外,2個分離自人源的科氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌的質(zhì)粒pRM01和p7LC,也與本研究中攜帶cfr基因的質(zhì)粒片段在序列上有高度相似性。14株cfr陽性菌株中有5株為ST188型,3株為ST965型,而近年來這些型別主要見于中國不同地區(qū)分離的動物源金黃色葡萄球菌。這些結(jié)果提示這14株金黃色葡萄球菌或者其攜帶的cfr基因可能來源于動物。 對位于23S rRNA domain V區(qū)的9個突變點,分別構(gòu)建其二級結(jié)構(gòu)和三級空間結(jié)構(gòu),對結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：(1)MIC為1μg/ml組中菌株沒有發(fā)現(xiàn)cfr基因或L蛋白突變,僅有的T2238C和G2398A突變點在三級結(jié)構(gòu)上距離利奈唑胺結(jié)合位點距離為94.91A和102.8A,可能是導(dǎo)致菌株對利奈唑胺MIC值輕微增高的原因。(2)MIC為2μg/ml組的位于23SrRNA domain V區(qū)的5個突變點中,突變點C2112T和C2129T在二級結(jié)構(gòu)中的堿基配對均由非常穩(wěn)定的G：C配對變?yōu)椴环�(wěn)定的G：U配對,這種二級結(jié)構(gòu)的改變可能使得rRNA莖區(qū)結(jié)構(gòu)變松散或進(jìn)一步影響三級空間結(jié)構(gòu)；突變點G2127A發(fā)生后,二級結(jié)構(gòu)中的堿基配對由不穩(wěn)定的G：U配對變?yōu)橄鄬Ψ�(wěn)定的A：U配對,也會使得二級結(jié)構(gòu)的rRNA莖區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性發(fā)生變化。并且本組的5個突變點C2112T, G2127A, C2129T, C2219T, C2263T在空間結(jié)構(gòu)上距離利奈唑胺結(jié)合位點距離分別為56.06A,51.96A,54.07A,58.83A,52.02A,距離相對較近,故這5個突變點在這些菌株中對利奈唑胺MIC增高具有較大貢獻(xiàn)價值。且這組菌株在L3或L22蛋白的氨基酸突變在空間上均位于核糖體肽酰轉(zhuǎn)移酶活性中心(peptidyl transferase center, PTC)區(qū)外,對利奈唑胺MIC值影響較小。(3)MIC為4μg/ml組細(xì)菌的突變點C2234T和G2416A在三級空間結(jié)構(gòu)距離利奈唑胺結(jié)合位點距離分別為92.16A和72.68A,距離較遠(yuǎn)。本組的11株菌株中有8株攜帶有cfr基因,而本組中的L3或L4蛋白氨基酸突變位于PTC區(qū)外,因此cfr基因可能是本組菌株對利奈唑胺MIC值升高的主因。 結(jié)論： 1.臨床分離菌株中,沒有檢出符合CLSI耐藥折點的菌株,但細(xì)菌MIC值分布范圍廣,最高M(jìn)IC值菌株和最低MIC值相差16倍,需要嚴(yán)密觀察敏感性降低的發(fā)展趨勢,避免耐藥菌株的出現(xiàn)。 2.隨著利奈唑胺MIC值的增高,細(xì)菌位于23S rRNA或L蛋白的突變點數(shù)量和類型均增多,這種逐漸遞增的突變點數(shù)量和突變類型可能為菌株由對利奈唑胺敏感變?yōu)槟退幪峁l件。 3.23S rRNA domain V區(qū)突變是MIC為2μg/ml組中菌株對利奈唑胺MIC增高的主因；而MIC為4μg/ml組中,利奈唑胺MIC增高的主因可能是cfr基因,而非23S rRNA domain V區(qū)突變。 4.cfr基因已經(jīng)在中國部分地區(qū)臨床金黃色葡萄球菌菌株中存在,MLST分型分析和cfr周圍基因環(huán)境分析提示這些菌株可能存在動物向人傳播的可能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R446.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1646402