本文關(guān)鍵詞：米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶在畢赤酵母中的表達(dá)、酶學(xué)特性及其應(yīng)用研究

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【摘要】：脯氨酰內(nèi)肽酶(Prolyl Endopeptidase,PEP)是一種能特異性水解小分子多肽中脯氨酸羧基端肽鍵的絲氨酸蛋白酶,在食品、發(fā)酵、醫(yī)藥、啤酒生產(chǎn)等行業(yè)有著非常重要的作用。然而,目前脯氨酰內(nèi)肽酶的蛋白表達(dá)量較低,不能適應(yīng)大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用。本文在實(shí)驗室前期開發(fā)獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶的基礎(chǔ)上,利用融合表達(dá)實(shí)現(xiàn)該米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá),并對融合蛋白進(jìn)行分離純化以及酶學(xué)性質(zhì)測定,通過7 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)一步提高了米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶的表達(dá)水平,并研究了該酶對啤酒酵液非生物穩(wěn)定性的影響。主要研究成果如下:(1)以紫紅色鏈霉菌磷脂酶PLA2,纖維素結(jié)構(gòu)域(CBD),泛素相關(guān)的小標(biāo)簽調(diào)節(jié)器(SUMO),麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)作為融合標(biāo)簽,構(gòu)建四種融合表達(dá)菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-SLMH,GS115/pPIC9K/pPICZαA-CLMH,GS115/pPIC9K/pPICZαA-MLMH,GS115/pPIC9K/pPICZαA-PLMH,連同出發(fā)菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-MOH,用熒光定量PCR方法鑒定目的基因拷貝數(shù),分別篩選出5拷貝的陽性克隆菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,比較它們在發(fā)酵過程中的菌體濃度,蛋白濃度及酶活。結(jié)果顯示,相較于出發(fā)菌株,四種融合蛋白的酶活分別提高了2.7,3.8,4.9,7.4倍。借助western blot方法對五種菌株胞內(nèi)胞外PEP蛋白進(jìn)行了鑒定。同時,對出發(fā)菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-MOH和融合表達(dá)菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-PLMH在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較,結(jié)果表明在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上,融合表達(dá)菌株是出發(fā)菌株的2.3倍。SDS-PAGE與質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示,脯氨酰內(nèi)肽酶在分泌表達(dá)過程中,發(fā)生了蛋白的自切割效應(yīng)。(2)研究了表達(dá)量最高的融合蛋白PLMH的酶學(xué)性質(zhì),并與初始蛋白MOH進(jìn)行比較。經(jīng)純化后,酶學(xué)性質(zhì)研究表明,PLMH及MOH最適溫度均為40°C,溫度穩(wěn)定性方面,當(dāng)溫度低于30°C時,穩(wěn)定性較好,當(dāng)溫度達(dá)到45°C時,剩余酶活幾乎為零;PLMH與MOH兩者最適pH均為5.5,pH穩(wěn)定性方面,pH在5.0-8.0之間穩(wěn)定性較好。此外,PLMH的Km,kcat,kcat/Km分別為0.23±0.01 mM,112.51±0.02 s-1,489.17s-1 mM-1,相比MOH,兩者動力學(xué)參數(shù)較為相近。(3)將融合表達(dá)菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-PLMH進(jìn)行7 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵,發(fā)酵條件為起始誘導(dǎo)OD600為110,甲醇誘導(dǎo)濃度1 g?L-1。誘導(dǎo)96 h時結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)果顯示,最高酶活出現(xiàn)在78 h,為960 U?L-1,最高蛋白濃度0.28 mg?mL-1,最高OD600660。(4)通過在啤酒后酵液中添加不同濃度的PLMH研究脯氨酰內(nèi)肽酶對啤酒后酵液非生物穩(wěn)定性的影響,與空白對照相比,脯氨酰內(nèi)肽酶不僅能降低啤酒發(fā)酵液中敏感蛋白的含量,同時還能提高啤酒后酵液在貯存期間的非生物穩(wěn)定性。
【關(guān)鍵詞】：脯氨酰內(nèi)肽酶 畢赤酵母 融合表達(dá) 酶學(xué)性質(zhì) 應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q55
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 緒論7-13
• 1.1 立題意義7
• 1.2 國內(nèi)外研究進(jìn)展7-12
• 1.2.1 脯氨酰內(nèi)肽酶簡介7
• 1.2.2 脯氨酰內(nèi)肽酶的應(yīng)用7-9
• 1.2.3 脯氨酰內(nèi)肽酶的表達(dá)9
• 1.2.4 米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶的表達(dá)9
• 1.2.5 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)概述9-10
• 1.2.6 提高外源蛋白表達(dá)量的策略10
• 1.2.7 融合表達(dá)10-12
• 1.3 本課題研究思路和內(nèi)容12-13
• 1.3.1 課題研究思路12
• 1.3.2 課題研究內(nèi)容12
• 1.3.3 課題來源12-13
• 第二章 實(shí)驗材料與方法13-22
• 2.1 實(shí)驗材料13-15
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒13
• 2.1.2 培養(yǎng)基與溶液13-14
• 2.1.3 主要試劑及儀器14-15
• 2.2 實(shí)驗方法15-22
• 2.2.1 重組PEP基因表達(dá)菌株的構(gòu)建15-16
• 2.2.2 重組PEP表達(dá)菌株的構(gòu)建16-17
• 2.2.3 重組陽性克隆菌株的篩選17
• 2.2.4 基因重組菌株的生長及表達(dá)17
• 2.2.5 脯氨酰內(nèi)肽酶酶活力測定方法17-18
• 2.2.6 重組菌株脯氨酰內(nèi)肽酶基因拷貝數(shù)的鑒定18
• 2.2.7 反轉(zhuǎn)錄法鑒定mRNA18-19
• 2.2.8 重組蛋白的鑒定19
• 2.2.9 重組蛋白的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)測定19-20
• 2.2.10 重組菌株在 7 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵20-21
• 2.2.11 脯氨酰內(nèi)肽酶對啤酒非生物穩(wěn)定性的研究21-22
• 第三章 結(jié)果與討論22-37
• 3.1 米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶在畢赤酵母中的表達(dá)22-25
• 3.2 米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶在畢赤酵母中的融合表達(dá)25-28
• 3.2.1 熒光定量PCR鑒定出發(fā)菌株及融合表達(dá)菌株的目的基因拷貝數(shù)26
• 3.2.2 融合表達(dá)菌株的搖瓶發(fā)酵26-28
• 3.2.3 融合蛋白western blot分析28
• 3.3 不同連接肽對以磷脂酶為融合標(biāo)簽的重組脯氨酸蛋白酶的影響28-29
• 3.4 融合蛋白轉(zhuǎn)錄水平分析29-30
• 3.5 米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶酶學(xué)性質(zhì)研究30-33
• 3.5.1 融合蛋白PLMH的MADLI-TOF-MS分析30-31
• 3.5.2 脯氨酰內(nèi)肽酶酶學(xué)性質(zhì)研究31-33
• 3.6 融合表達(dá)菌株畢赤酵母基因工程菌的 7 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)33-35
• 3.7 脯氨酰內(nèi)肽酶對啤酒非生物穩(wěn)定性的應(yīng)用研究35-37
• 3.7.1 不同加酶量對成品啤酒貯存期間的穩(wěn)定性研究35
• 3.7.2 不同加酶量對啤酒發(fā)酵液中渾濁蛋白的影響35-37
• 主要結(jié)論與展望37-39
• 主要結(jié)論37-38
• 展望38-39
• 致謝39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 附錄：附表44-45
• 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文45

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