本文關(guān)鍵詞：Cry1A類(lèi)蛋白交換結(jié)構(gòu)域?qū)⑾x(chóng)活性影響的研究

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【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一種廣泛分布的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,在形成芽胞的同時(shí)能產(chǎn)生由cry或cyt基因編碼的殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs),對(duì)多種害蟲(chóng)有特異殺蟲(chóng)活性。目前,Bt不僅被開(kāi)發(fā)成生物農(nóng)藥在害蟲(chóng)防治中得到應(yīng)用,表達(dá)Bt Cry蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物也已經(jīng)被廣泛種植,帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益。其中Cry1A是一個(gè)對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)有高活性的殺蟲(chóng)蛋白家族,目前已知的Cry1A類(lèi)基因有10個(gè)模式種類(lèi),112個(gè)殺蟲(chóng)基因。這些基因中cry1Ab、cry1Ac應(yīng)用最為廣泛,cry1Ah基因是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所克隆的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的殺蟲(chóng)基因,其編碼的Cry1Ah蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis)和水稻二化螟(Chilo suppressalis)等多種鱗翅目害蟲(chóng)具有很高的毒殺活性,超過(guò)目前商業(yè)化的cry1Ab、cry1Ac等基因,具有巨大的應(yīng)用前景,目前正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物研究。對(duì)目前已經(jīng)明確殺蟲(chóng)活性蛋白的各結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列比對(duì)聚類(lèi)發(fā)現(xiàn),部分殺蟲(chóng)活性(特別是Cry1類(lèi)蛋白)可以由結(jié)構(gòu)域III的重組獲得,Cry毒素結(jié)構(gòu)域交換是一種殺蟲(chóng)特異性進(jìn)化的機(jī)制。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah三個(gè)蛋白之間有共同的結(jié)構(gòu)域II;Cry1Ab、Cry1Ac有共同的結(jié)構(gòu)域I;而Cry1Ac、Cry1Ah有共同的結(jié)構(gòu)域III。Cry1Ab結(jié)構(gòu)域III與Cry1Ac、Cry1Ah不同,但是在Cry1A家族中比較常見(jiàn),與Cry1Aa、Cry1Ae、Cry1Af等蛋白結(jié)構(gòu)域III序列一致性大于97%;Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I比較獨(dú)特,不僅與Cry1Ab、Cry1Ac不同,與所有報(bào)道的Bt殺蟲(chóng)蛋白的結(jié)構(gòu)域I差異都較大。本研究通過(guò)同源建模的方法比較了Cry1Ab,Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I結(jié)構(gòu)、表面電荷分布特點(diǎn);進(jìn)一步構(gòu)建了編碼cry1Ah與cry1Ab、cry1Ca雜合基因;并對(duì)部分雜合基因進(jìn)行了表達(dá)與功能研究,取得結(jié)果如下。利用SWISS-MODEL建模分別獲得了Cry1Ah1與Cry1Ab13結(jié)構(gòu)域I以及三個(gè)結(jié)構(gòu)域核心活性區(qū)的機(jī)構(gòu)信息,通過(guò)分子疊合比對(duì)發(fā)現(xiàn),盡管Cry1Ah1與Cry1Ab13序列存在較大差異(31%),但是兩者結(jié)構(gòu)域I的碳骨架沒(méi)有差異。進(jìn)一步分析了結(jié)構(gòu)域I的表面結(jié)構(gòu)與表面靜電勢(shì)分布,結(jié)果顯示盡管兩個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域I的碳骨架沒(méi)有差異,由于氨基酸序列以及氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)不同,兩個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)表面以及電勢(shì)分布都有所不同。通無(wú)縫克隆方法,構(gòu)建了4種雜合基因;AhAhCa含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I、II和Cry1Ca結(jié)構(gòu)域III;p ET-AHAHAB含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I、II和Cry1Ab結(jié)構(gòu)域III;AhAbAb含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I和Cry1Ab結(jié)構(gòu)域II、III;PET-AHCACA含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I和Cry1Ca結(jié)構(gòu)域II、III。成功表達(dá)了Cry1Ab、Cry1Ah的雜合蛋白p ET-AHAHAB并測(cè)定了殺蟲(chóng)活性,結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)域交換引起蛋白殺蟲(chóng)譜的顯著變化。這些數(shù)據(jù)表明,3D-Cry蛋白殺蟲(chóng)特異性可能不僅和結(jié)構(gòu)域II、結(jié)構(gòu)域III有關(guān),還有可能與包括結(jié)構(gòu)域I在內(nèi)的三個(gè)結(jié)構(gòu)域的組合有關(guān)。3D-Cry蛋白中3個(gè)結(jié)構(gòu)域兩兩之間都有接觸,包括結(jié)構(gòu)域I在內(nèi)的不同的結(jié)構(gòu)域組合都會(huì)影響蛋白結(jié)構(gòu)表面微環(huán)境的變化,這些變化可能會(huì)對(duì)Cry蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生影響。進(jìn)一步分析雜合蛋白殺蟲(chóng)特異性變化的原因?qū)M(jìn)一步揭示3D-Cry蛋白殺蟲(chóng)特異性進(jìn)化機(jī)制有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：蘇云金芽胞桿菌 結(jié)構(gòu)與功能 pET-AHAHCA pET-AHAHAB
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S482.39
【目錄】：

• 摘要9-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-28
• 1.1 蘇云金芽胞桿菌13
• 1.2 蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)蛋白13-23
• 1.2.1 Cry蛋白13-14
• 1.2.2 Cry蛋白命名14-15
• 1.2.3 Cry蛋白作用機(jī)制15
• 1.2.4 Cry蛋白結(jié)構(gòu)15-21
• 1.2.5 Cry蛋白的進(jìn)化21-23
• 1.3 Cry1Ah蛋白23-24
• 1.4 Cry1Ab蛋白24-25
• 1.5 Cry1Ca蛋白25-27
• 1.6 本研究的目的與意義27
• 1.7 立題依據(jù)27-28
• 2 材料與方法28-36
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 供試菌株和質(zhì)粒28
• 2.1.2 引物合成及序列測(cè)定28-29
• 2.1.3 抗生素29
• 2.1.4 培養(yǎng)基29
• 2.1.5 核酸電泳試劑29
• 2.1.6 E.coli質(zhì)粒DNA提取29-30
• 2.1.7 生化試劑和酶30
• 2.1.8 標(biāo)準(zhǔn)分子量30
• 2.1.9 SDS - PAGE試劑30
• 2.1.10其他試劑30-31
• 2.2 儀器設(shè)備31
• 2.3 供試?yán)ハx(chóng)31
• 2.4 試驗(yàn)方法31-34
• 2.4.1 大腸桿菌質(zhì)粒提取31-32
• 2.4.2 PCR擴(kuò)增程序32
• 2.4.3 重疊PCR擴(kuò)增32
• 2.4.4 轉(zhuǎn)化32-33
• 2.4.5 基因鑒定33
• 2.4.6 序列的測(cè)定及分析33
• 2.4.7 雜合蛋白表達(dá)33-34
• 2.5 蛋白電泳檢測(cè)34
• 2.6 殺蟲(chóng)活性測(cè)定34-36
• 2.6.1 小菜蛾生物活性測(cè)定34-35
• 2.6.2 玉米螟生物活性測(cè)定35
• 2.6.3 甜菜夜蛾、棉鈴蟲(chóng)的生物活性測(cè)定35
• 2.6.4.猿葉甲生物活性測(cè)定35-36
• 3 結(jié)果與分析36-55
• 3.1 pET-AHAHAB構(gòu)建36-42
• 3.1.1 Cry1Ah與Cry1Ab、pET-AHAHAB序列比較36
• 3.1.2 Cry1Ah與Cry1Ab結(jié)構(gòu)域I比較36-37
• 3.1.3 Cry1Ah與Cry1Ab雜合蛋白構(gòu)建37-38
• 3.1.4 pET-AHAHAB蛋白定量結(jié)果38-39
• 3.1.5 pET-AHAHAB生物活性測(cè)定39-42
• 3.2 AhAhCa構(gòu)建42-47
• 3.2.1 Cry1Ah1與Cry1Ca7、AhAhCa序列比較42-43
• 3.2.2 Cry1Ah與Cry1Ca結(jié)構(gòu)域I比較43-44
• 3.2.3 Cry1Ah與Cry1Ca雜合蛋白構(gòu)建44
• 3.2.4 構(gòu)建雜合蛋白測(cè)序結(jié)果44-45
• 3.2.5 AhAhCa蛋白定量結(jié)果45
• 3.2.6 AhAhCa生物活性測(cè)定45-47
• 3.3 AhAb Ab構(gòu)建47-50
• 3.3.1 Cry1Ah與Cry1Ab、AhAbAb序列比較47
• 3.3.2 Cry1Ah與Cry1Ab雜合蛋白構(gòu)建47-48
• 3.3.3 cry1Ah和cry1Ab13 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物48
• 3.3.4 AhAbAb酶切鑒定結(jié)果48
• 3.3.5 AhAbAb轉(zhuǎn)Rosetta PCR鑒定結(jié)果48-49
• 3.3.6 AhAbAb蛋白表達(dá)49
• 3.3.7 p ET-AHABAB 生物活性測(cè)定49-50
• 3.4 pET-AHCACA構(gòu)建50-55
• 3.4.1 Cry1Ah與Cry1Ca、pET-AHCACA序列比較50-51
• 3.4.2 cry1Ah和cry1Ca7 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物51
• 3.4.3 p ET-AHCACA酶切鑒定結(jié)果51-52
• 3.4.4 pET-AHCACA轉(zhuǎn)Rosetta PCR鑒定結(jié)果52
• 3.4.5 pET-AHCACA表達(dá)52-53
• 3.4.6 pET-AHCACA生物活性測(cè)定53-55
• 4 討論55-57
• 5 結(jié)論57-58
• 致謝58-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 附錄66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 代平禮;轉(zhuǎn)Bt cry1Ah基因玉米對(duì)蜜蜂的安全性研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

2 岳同卿;轉(zhuǎn)Bt Cry1 Ah基因抗蟲(chóng)玉米的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2009年

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本文編號(hào)：664439