本文關(guān)鍵詞：基于高熒光碳點(diǎn)的免疫熒光探針的構(gòu)建及其在微生物檢測中的應(yīng)用研究

  更多相關(guān)文章： 熒光抗體技術(shù) 免疫熒光探針 碳點(diǎn) 特異性 大腸桿菌O157:H7

【摘要】：目的:以檸檬酸為碳源,采用微波加熱一步法,制備表面經(jīng)鈍化劑修飾的熒光碳點(diǎn),通過優(yōu)化制備過程和反應(yīng)條件,達(dá)到高熒光量子產(chǎn)率,并研究其發(fā)光機(jī)理。將碳點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物和大腸桿菌抗體分子結(jié)合,構(gòu)建免疫熒光探針,以腸出血性大腸桿菌O157:H7為目標(biāo)檢測物,利用抗體-抗原特異性結(jié)合特性,觀察大腸桿菌樣本與探針結(jié)合后的熒光性,驗(yàn)證碳點(diǎn)在免疫熒光探針的構(gòu)建是否成功,探索碳點(diǎn)基免疫熒光探針在大腸桿菌檢測中的應(yīng)用。期望制備一種低毒、經(jīng)濟(jì)、高效、穩(wěn)定的碳點(diǎn)作為免疫熒光探針的熒光標(biāo)記物,安全、高效地識別目標(biāo)檢測物。內(nèi)容與方法:本論文擬在以下幾個(gè)方面開展工作:(1)選擇無水檸檬酸為碳源,聚乙烯亞胺(PEI)為修飾劑,通過微波法直接合成表面氨基化的碳點(diǎn),無需再進(jìn)行表面修飾,合成熒光性能良好的熒光碳點(diǎn);系統(tǒng)研究微波時(shí)間、反應(yīng)物配比等合成條件對碳點(diǎn)的產(chǎn)率、結(jié)構(gòu)、組成、微觀形貌、粒徑大小及其分布的影響,揭示碳點(diǎn)的形成規(guī)律,進(jìn)行透射電鏡(TEM)、紅外光譜(FTIR)、熒光光譜(FL)、紫外吸收光譜(UV)等表征手段,分析其成分、結(jié)構(gòu)、形貌特征。(2)將碳點(diǎn)與大腸桿菌抗體通過酰胺化反應(yīng)化學(xué)偶聯(lián),形成免疫熒光探針;選擇與大腸桿菌類似的其他細(xì)菌作為對照模型,分析碳點(diǎn)與對照模型之間、免疫熒光探針與對照模型之間的相互作用及非特異吸附性能,研究免疫熒光探針的專一性。(3)探索基于碳點(diǎn)的免疫熒光探針在大腸桿菌檢測中的應(yīng)用,建立大腸桿菌濃度與探針熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系,確定檢測限。結(jié)果:(1)通過實(shí)驗(yàn)證明了PEI修飾的碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度比無PEI修飾的碳點(diǎn)明顯增強(qiáng),同時(shí)增加了碳點(diǎn)表面的氨基功能基團(tuán),使未來免疫熒光探針的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。表征結(jié)果顯示,碳點(diǎn)呈球形,粒徑分布范圍窄,平均粒徑3 nm,小于10 nm,粒徑小可以盡可能的減小對生物的干擾。碳點(diǎn)的熒光性能優(yōu)良,熒光量子產(chǎn)率達(dá)到了46.7%,略低于作為標(biāo)準(zhǔn)物的硫酸奎寧(熒光量子產(chǎn)率為54%),達(dá)到了較高的熒光量子產(chǎn)率。而且光穩(wěn)定性強(qiáng),可長時(shí)間保持穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長為360 nm時(shí),具有最強(qiáng)的熒光發(fā)射峰,在440 nm左右。合成的碳點(diǎn)具有隨著激發(fā)波長的紅移,發(fā)射波長也隨之紅移的現(xiàn)象,在紫外光激發(fā)下發(fā)射藍(lán)色熒光,在藍(lán)色光激發(fā)下發(fā)射綠色熒光,在綠色光激發(fā)下發(fā)射紅色熒光,因此可用于多色熒光成像。實(shí)驗(yàn)對制備碳點(diǎn)過程中的原料配比、pH、微波時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化,碳點(diǎn)的最優(yōu)合成條件是無水檸檬酸和聚乙烯亞胺配比3:1,并且此時(shí)的溶液pH值為5,呈弱酸性,微波時(shí)間為10 min。獲得的碳點(diǎn)粒徑均勻,分布范圍窄,并且熒光性能優(yōu)良。(2)通過碳點(diǎn)與E.coli O157:H7孵育,利用粒徑小的優(yōu)勢,通過細(xì)菌的內(nèi)吞作用,碳點(diǎn)進(jìn)入到了細(xì)菌的內(nèi)部,實(shí)現(xiàn)了對E.coli O157:H7的熒光標(biāo)記和成像,說明了碳點(diǎn)具有好的生物相容性,能夠穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部。此外,碳點(diǎn)對E.coli O157:H7的熒光標(biāo)記,可以產(chǎn)生多色熒光,在紫外、藍(lán)色和綠色光激發(fā)下,細(xì)菌呈現(xiàn)藍(lán)色、綠色和紅色熒光圖像。在未來的熒光成像應(yīng)用中,我們可以采用波長較長的激發(fā)光源,減少目標(biāo)標(biāo)記物自體熒光的干擾。采用MTT法測定了碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性,結(jié)果表明即使在我們實(shí)驗(yàn)所用最高濃度1.2mg/mL時(shí),細(xì)胞仍然具有80%以上的存活率,充分表明碳點(diǎn)的低細(xì)胞毒性的優(yōu)點(diǎn)。(3)通過EDC/NHS偶聯(lián)法將氨基修飾的碳點(diǎn)和抗體共價(jià)結(jié)合,構(gòu)建了一種基于碳點(diǎn)的免疫熒光探針,使碳點(diǎn)這種新型的熒光納米材料成功應(yīng)用在了熒光抗體技術(shù)中。能夠在較短時(shí)間內(nèi)特異性的識別E.coli O157:H7,并且多色熒光成像。我們基于碳點(diǎn)構(gòu)建的免疫熒光探針能夠快速的檢測樣本中的E.coli O157:H7,檢測靈敏度達(dá)到103CFU/mL,并可在短時(shí)間內(nèi)(1 h)完成,可通過便攜式光譜儀實(shí)現(xiàn)野外環(huán)境下的快速偵檢。結(jié)論:我們成功制備了一種較高熒光量子產(chǎn)率的碳點(diǎn),比將其應(yīng)用到了熒光抗體技術(shù)中,構(gòu)建了免疫熒光探針,特異性地識別了E.coli O157:H7,并達(dá)到了較高的靈敏度。我們相信,在目前的不足和問題解決之后,碳點(diǎn)作為一種新型的熒光納米材料,在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用一定會(huì)得到極大地推動(dòng),有望成為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型低毒生物傳感器,拓展至病毒和其他細(xì)菌微生物的檢測,在理論和實(shí)際應(yīng)用中具有重要的價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：熒光抗體技術(shù) 免疫熒光探針 碳點(diǎn) 特異性 大腸桿菌O157:H7
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R446.6
【目錄】：

• 縮略詞表7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 緒論13-30
• 1.1 前言13-14
• 1.2 熒光碳點(diǎn)的概述14
• 1.3 碳點(diǎn)的制備14-19
• 1.3.1 自上而下法14-16
• 1.3.2 自下而上法16-19
• 1.4 碳點(diǎn)的性能19-21
• 1.4.1 結(jié)構(gòu)特性19
• 1.4.2 光學(xué)特性19-21
• 1.4.3 碳點(diǎn)的毒性和生物相容性21
• 1.5 碳點(diǎn)的應(yīng)用21-26
• 1.5.1 環(huán)境檢測21-23
• 1.5.2 生物成像23-24
• 1.5.3 光催化應(yīng)用24-25
• 1.5.4 其他應(yīng)用25-26
• 1.6 熒光抗體技術(shù)26-28
• 1.6.1 熒光抗體技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀26-27
• 1.6.2 碳點(diǎn)在熒光抗體技術(shù)中的應(yīng)用27-28
• 1.7 課題研究主要內(nèi)容28-30
• 第二章 微波法制備熒光碳點(diǎn)30-44
• 2.1 引言30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑和材料31
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 2.4.1 碳點(diǎn)的制備31-32
• 2.4.2 碳點(diǎn)的表征32-33
• 2.5 結(jié)果與討論33-42
• 2.5.1 碳點(diǎn)的結(jié)構(gòu)表征33-34
• 2.5.2 碳點(diǎn)的紅外光譜表征34-35
• 2.5.3 碳點(diǎn)的紫外吸收光譜和熒光性能35-39
• 2.5.4 碳點(diǎn)性能影響因素39-42
• 2.6 本章小結(jié)42-44
• 第三章 碳點(diǎn)的細(xì)菌熒光成像和細(xì)胞毒性44-49
• 3.1 引言44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器44-45
• 3.3 實(shí)驗(yàn)試劑和材料45
• 3.4 實(shí)驗(yàn)方法45-46
• 3.4.1 E.coli O157:H7的培養(yǎng)45-46
• 3.4.2 碳點(diǎn)對E.coli O157:H7的熒光成像46
• 3.4.3 MTT細(xì)胞毒性評價(jià)46
• 3.5 結(jié)果與討論46-48
• 3.5.1 碳點(diǎn)標(biāo)記E.coli O157:H7的熒光成像46-48
• 3.5.2 碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性48
• 3.6 本章小結(jié)48-49
• 第四章 免疫熒光探針的構(gòu)建及E.coli O157:H7的特異性識別與檢測49-58
• 4.1 引言49-50
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器50
• 4.3 實(shí)驗(yàn)試劑和材料50-51
• 4.4 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 4.4.1 免疫熒光探針的構(gòu)建51-52
• 4.4.2 E.coli O157:H7的培養(yǎng)52
• 4.4.3 E.coli O157:H7的特異性識別52
• 4.4.4 E.coli O157:H7的濃度檢測52-53
• 4.5 結(jié)果與討論53-56
• 4.5.1 構(gòu)建的免疫熒光探針53-54
• 4.5.2 C-Abs對E.coli O157:H7的特異性識別54
• 4.5.3 C-Abs對E.coli O157:H7的濃度檢測54-56
• 4.6 本章小結(jié)56-58
• 第五章 總結(jié)與展望58-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 在學(xué)期間取得的成果及發(fā)表的代表性論著68-69
• 作者簡歷69-70
• 致謝70-71

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