本文選題：炭疽毒素 + 類受體�。� 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2016年博士論文

【摘要】：炭疽是一種烈性的人畜共患傳染病,其病原體是炭疽芽胞桿菌。炭疽芽胞桿菌形成的芽胞對環(huán)境抵抗力強并且容易制備,是一種潛在的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑。炭疽芽胞桿菌的毒力因子主要包括細菌莢膜和外毒素,莢膜能夠幫助炭疽桿菌逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊從而促進細菌在體內(nèi)的大量繁殖;外毒素由保護性抗原(PA)、致死因子(LF)和水腫因子(EF)三種蛋白質(zhì)成分組成,是導致宿主死亡的主要原因。PA通過與靶細胞表面的受體(CMG2或TEM8)結合后,介導LF和EF進入細胞發(fā)揮毒性作用。目前臨床上對于炭疽的治療主要使用抗生素,但抗生素僅能殺滅炭疽桿菌,無法抑制炭疽毒素的作用,因此對感染晚期及重癥患者療效不佳,發(fā)展針對炭疽毒素的特異性藥物十分必要。目前針對炭疽毒素的藥物研究主要包括單克隆抗體、特異性免疫球蛋白、小分子抑制劑等。我們的前期研究及其他實驗室的報道均顯示重組表達的可溶性炭疽毒素受體片段(稱為“類受體”)可與細胞表面的受體競爭結合炭疽毒素,從而阻斷毒素進入細胞,是一類新型的炭疽毒素抑制劑。本研究對實驗室前期獲得的類受體分子進行了優(yōu)化設計和藥效評價,主要內(nèi)容包括通過與抗體Ig G Fc段或人血清白蛋白(HSA)融合等方式,延長類受體分子的體內(nèi)半衰期;通過對影響與PA親和力的關鍵氨基酸位點的組合突變來提高類受體分子與PA的親和力;利用細胞模型和動物模型對候選分子進行藥效評價和分析比較,從而確定類受體候選藥物分子結構,為研制開發(fā)新型抗炭疽藥物打下基礎。CMG2是炭疽感染過程中的主要細胞受體,研究顯示s CMG2(可溶性CMG2片段)與PA的親和力較高,并且在體內(nèi)外實驗中顯示出良好的抗炭疽毒素活性。但是s CMG2血漿半衰期短,影響了其成藥性。融合抗體Ig G Fc段是延長蛋白藥物體內(nèi)半衰期的常用方法,本研究首先構建了s CMG2與人Ig G1 Fc融合的表達質(zhì)粒,通過瞬時轉(zhuǎn)染293F細胞,經(jīng)過Protein G柱純化獲得融合蛋白(CMG2-Fc)。通過對炭疽毒素敏感的J774A.1細胞模型,對CMG2-Fc及s CMG2的生物學活性進行了比較分析,二者的毒素中和活性IC50分別為1.45 n M(CMG2-Fc)和2.03 n M(s CMG2),表明融合Fc后s CMG2活性沒有受到影響。通過尾靜脈將CMG2-Fc注射入SD大鼠體內(nèi),采用ELISA方法檢測不同時間點血漿中CMG2-Fc含量,推算CMG2-Fc的體內(nèi)半衰期為29.98 h,相較s CMG2延長了約60倍。在Fisher344大鼠模型上進行炭疽致死毒素(Le Tx,20μg rPA+10μg r LF)攻擊的體內(nèi)保護效果評價,比較了CMG2-Fc與sCMG2的毒素抑制活性,結果顯示CMG2-Fc能夠顯著延長大鼠的存活時間,但不能保護大鼠存活,而s CMG2則可以完全保護大鼠。推測導致這種結果的原因可能是Fc自身的一些功能,如ADCC或CDC效應影響了CMG2-Fc在體內(nèi)的活性,這仍須進一步的試驗驗證。上述結果表明,與Fc融合盡管顯著提高了s CMG2半衰期,但體內(nèi)毒素抑制活性下降,不是一種理想的類受體分子設計。與人血清白蛋白HSA融合是提高蛋白藥物半衰期的另一種常用策略。本研究構建了s CMG2與HSA的融合蛋白(HSA-CMG2),通過3×G4S的linker將HSA和s CMG2連接,將基因片段插入酵母表達載體p MEX9K,電轉(zhuǎn)畢赤酵母GS115,進行甲醇誘導分泌表達,通過Blue親和層析、陰離子交換層析獲得純化蛋白。HSA-CMG2在大鼠體內(nèi)的半衰期為5.01 h,相較s CMG2的體內(nèi)半衰期延長了10倍以上。在J774A.1細胞模型上的毒素中和活性結果顯示,HSA-CMG2的IC50為1.83 n M,與CMG2-Fc和s CMG2相近。在Fisher344大鼠模型上進行了體內(nèi)保護效果評價,將HSA-CMG2與Le Tx預混合,再通過尾靜脈注射入大鼠體內(nèi),結果顯示與毒素摩爾比為2:1時,能夠保護大鼠存活;在大鼠注射Le Tx前預防性給藥,結果提前5分鐘給藥,HSA-CMG2和s CMG2組全部存活,如提前24 h給藥,HSA-CMG2能夠顯著延長大鼠的存活時間,而s CMG2組存活時間與對照組(僅攻毒)無顯著性差異。上述結果表明,s CMG2與HSA融合既延長了半衰期,又保持了較高的毒素抑制活性,是一個較理想的類受體藥物候選分子。TEM8是另一種炭疽毒素受體,由于其與PA的親和力較CMG2低10倍左右,因此s TEM8(可溶性TEM8片段)對炭疽毒素的抑制活性很低。實驗室前期根據(jù)結構預測設計出s TEM8突變體L56A(本研究中稱為MT2),與PA的親和力顯著提高。本研究在此基礎上,通過聯(lián)合突變多個影響s TEM8與PA親和力的關鍵氨基酸位點,篩選到一個新的類受體分子MT4。利用E.coli表達系統(tǒng),制備了出重組MT4。體外親和力測定結果顯示MT4與PA的親和力為0.374 n M,高與s CMG2(1.01 n M)和MT2(0.52 n M)。細胞試驗顯示MT4與s CMG2的IC50接近(分別為2.59 n M和1.46 n M),好于MT2(4.45 n M),較s TEM8提高了近12倍(27.2 n M)。大鼠試驗顯示MT4和s CMG2在與Le Tx摩爾比為1:1時能夠100%保護大鼠,而MT2的保護率為40%。以上結果表明,基于s TEM8的突變體分子MT4顯著提高了與PA的親和力,并且有與s CMG2相似的毒素抑制活性。MT4同樣存在體內(nèi)半衰期短的問題,本研究構建了MT4與Ig G1 Fc的融合蛋白(MT4-Fc)。但細胞試驗發(fā)現(xiàn)MT4融合Fc后毒素抑制活性下降了約10倍。由于MT4-Fc和MT4分別由293F細胞和E.coli表達系統(tǒng)制備,推測MT4-Fc活性下降可能與細胞表達系統(tǒng)的糖基化修飾有關。將MT4上兩個潛在N糖基化修飾位點突變后,E.coli表達的突變體MT4D與MT4的活性沒有明顯差異,而293F細胞表達的MT4D-Fc相較MT4-Fc毒素中和活性得到了部分恢復,因此在使用哺乳動物細胞表達s TEM8來源的類受體分子需要考慮糖基化修飾對類受體毒素中和活性的影響。本研究進一步參照HSA-CMG2的設計將MT4與HSA進行融合并在酵母系統(tǒng)中表達制備獲得HSA-MT4。HSA-MT4在大鼠體內(nèi)半衰期約為5 h,細胞試驗顯示HSA-MT4的毒素中和活性(IC50為2.95 n M)與MT4的相近,大鼠試驗顯示HSA-MT4與Le Tx預混注射能夠完全保護動物存活。上述結果表明HSAMT4也可以作為類受體藥物的候選分子。綜上所述,本研究構建并純化獲得新型抗炭疽類受體分子HSA-CMG2,延長了s CMG2的體內(nèi)半衰期,在體內(nèi)外試驗中均具有很好的毒素抑制活性;設計了基于s TEM8的類受體分子MT4,與PA的親和力高與s CMG2,毒素抑制活性與s CMG2相似,并通過與HSA融合獲得HSA-MT4,延長了MT4的體內(nèi)半衰期。HSA-CMG2與HSA-MT4均可以作為抗炭疽類受體藥物的候選分子,為研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的新型特異性炭疽治療藥物打下基礎。
[Abstract]:Bacillus anthracis ( CMG2 ) is a kind of new type of anthrax toxin inhibitor . It is a new type of anthrax toxin inhibitor . The results showed that the fusion protein ( HSA - CMG2 ) with HSA - CMG2 could prolong the survival time of the rats . The results showed that the fusion of HSA - CMG2 with HSA could prolong the survival time of rats . The results showed that the fusion of HSA - CMG2 with HSA could prolong the survival time of rats . The results showed that the fusion of HSA - CMG2 with HSA could prolong the half - life of rats . The results showed that the fusion of HSA - CMG2 with HSA could prolong the half - life of rats . The results showed that the affinity of MT4 and PA was 0.374 n M , high and s CMG2 ( 1.01 n M ) and MT2 ( 0.52 n M ) . The affinity of MT4 and PA was 0.374 n M , higher than that of S CMG2 ( 1.01 n M ) and MT2 ( 0.52 n M ) . The IC50 of MT4 and s CMG2 was close to ( 2.59 n M and 1 . 46 n M , respectively ) , better than MT2 ( 4.45 n M ) , which was nearly 12 times higher than that of s TEM8 ( 27 . 2 n M ) . The results showed that MT4 and HSA - MT4 could be used as candidate molecules for anti - anthrax receptor . The results showed that MT4 - Fc and MT4 were similar to those of MT4 . The results showed that MT4 - Fc and MT4 could be used as candidate molecules for the expression of MT4 . The results showed that MT4 - Fc and MT4 were similar to those of MT4 .
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R91

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本文編號：2093260