本文選題：NGAL + 單克隆抗體��； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2013年碩士論文

【摘要】：中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是Kjeldsen等人1993年研究中性粒細胞中92kDa的明膠酶，即MMP9時發(fā)現(xiàn)的一種新的脂質(zhì)運載蛋白(又名lipocalin)。NGAL存在于中性粒細胞中的過氧化物酶陰性顆粒中，并在人體組織細胞中廣泛分布，如支氣管、胃、小腸、胰腺、腎、前列腺、胸腺等。研究表明，，NGAL蛋白具有運輸疏水性小分子、調(diào)節(jié)MMP9活性、參與體內(nèi)Fe轉(zhuǎn)運等功能，并可能參與免疫炎癥反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，特別是腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移等過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，NGAL與腎臟關(guān)系十分密切。NGAL通過介導(dǎo)鐵的轉(zhuǎn)運來刺激早期原始腎臟系膜細胞轉(zhuǎn)化為腎臟上皮細胞，從而啟動腎臟發(fā)育。此外，NGAL可以通過轉(zhuǎn)運細胞內(nèi)鐵從而消除鐵在細胞內(nèi)堆積引起的細胞損傷，也可以引起白細胞凋亡減輕炎癥反應(yīng)而發(fā)揮保護腎臟的作用。眾多實驗室和臨床研究表明，腎損傷時NGAL表達明顯增高并分泌釋放入體液中。尤其是尿液中的NGAL水平與腎臟損傷的程度密切相關(guān)且很早就表現(xiàn)出來，NGAL被認為是新的早期腎損傷生化標志物。為將NGAL轉(zhuǎn)化入臨床應(yīng)用，制備特異性NGAL抗體并建立相應(yīng)的NGAL免疫檢測方法非常重要。在本研究中，我們利用生物信息學工具分析NGAL蛋白的性質(zhì)并通過HEK293T細胞重組表達了重組人NGAL蛋白(rhNGAL)作為抗體制備的篩選原和標準品。以購買的NGAL重組蛋白為免疫原制備出特異性NGAL單克隆抗體并建立起NGAL免疫學檢測方法。在此基礎(chǔ)上以293T細胞表達的rhNGAL為標準品對該方法進行全面的方法學評價，最后對57例臨床標本進行了檢測，初步證明本檢測方法能夠區(qū)分正常標本和腎臟損傷標本NGAL水平的差異。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果 1. pcDNA3.1/His A NGAL的構(gòu)建及其在HEK293T細胞中的表達和純化 通過分子生物學軟件工具的預(yù)測發(fā)現(xiàn)NGAL蛋白且具有較多的糖基化位點和磷酸化位點，說明NGAL蛋白翻譯后修飾加工和蛋白結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，原核表達的蛋白不易形成正確的蛋白構(gòu)象，難以獲得理想的檢測抗體。鑒于NGAL分子特點和前期工作經(jīng)驗，本研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了pcDNA3.1/His A NGAL真核表達載體，在HEK293T細胞中表達rhNGAL并進行純化，獲得0.18mg rhNGAL用作制備單克隆抗體篩選原和標準品，為下一步研究奠定必要的基礎(chǔ)。 2.抗人NGAL單克隆抗體的制備和鑒定 利用購買的NGAL重組蛋白作為免疫原經(jīng)皮下多點注射和腹腔注射途徑免疫Balb/c小鼠，經(jīng)兩次細胞融合和篩選獲得10株分泌抗NGAL的單克隆抗體細胞株，經(jīng)進一步檢測篩選最后制備獲得4株高效特異的抗NGAL單克隆抗體。隨后利用ELISA和WB等方法對4株抗體進行了鑒定：4株抗體亞類如下：1F2，1G2和4H11是IgG1，1H5是IgG2b。4株抗體抗原結(jié)合力強，特異性良好，不與無關(guān)蛋白反應(yīng)。在IHC染色中4株抗體均可以與腎組織切片中天然抗原結(jié)合，陽性主要定位于腎小管上皮細胞胞漿中。通過截短表達NGAL蛋白和合成B細胞表位肽的方法鑒定抗體的抗原表位，其中單克隆抗體1H5的B細胞表位位于NGAL蛋白第20至36位氨基酸處。而其余3株抗體無法與截短的NGAL蛋白片段和表位肽反應(yīng)。本部分工作成功制備了特異性好、效價高的NGAL單克隆抗體，為下一步NGAL免疫學檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ) 3. NGAL ELISA定量檢測方法建立和初步臨床應(yīng)用研究 本研究以第二部分制備獲得的高效特異性單克隆抗體為原料，兩兩配對篩選，建立了以1F2為捕獲抗體，酶標1G2為檢測抗體的雙抗體夾心ELISA方法。應(yīng)用棋盤滴定法確定ELISA體系最佳工作條件。通過方法學評價可知本方法線性范圍0～40ng/ml，靈敏度達到4.8ng/ml，平均回收率101.9％，最大批內(nèi)CV≤10.04%，最大批間CV≤9.76%。我們收集了57例臨床尿液標本，其中24例為正常對照組，33例為腎損傷患病組。用本ELISA系統(tǒng)進行樣本檢測，患病組尿液NGAL水平明顯高于正常對照組尿NGAL水平，有統(tǒng)計學意義(P0.01)。隨后選取3例腎病患者尿液和1例健康體檢者尿液為抗原，1F2和1G2為一抗做WB分析表明腎病患者尿液標本出現(xiàn)陽性條帶而體檢者尿液標本為陰性，表明1F2和1G2單克隆抗體能夠識別體液標本中天然抗原。本ELISA檢測體系經(jīng)方法學評價，各方面參數(shù)良好，臨床小樣本檢測與臨床診斷相符，為研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的NGAL免疫檢測試劑并以此為基礎(chǔ)發(fā)展NGAL其他靈敏快捷的相關(guān)醫(yī)學檢驗技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:涓

本文編號：2073794