本文選題：抗草甘膦 + EPSPS�。� 參考：《山東大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：草甘膦因?yàn)槠涓咝�、廣譜性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型、低毒等特點(diǎn),是當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用面積最廣、生產(chǎn)銷量最大、最具商業(yè)價(jià)值的的一種除草劑。其作用的機(jī)制是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的抑制植物莽草酸途徑的關(guān)鍵酶5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,簡(jiǎn)稱EPSP合成酶)的催化作用阻斷植物芳香族氨基酸的合成,進(jìn)而導(dǎo)致植物失綠死亡。此外,由于草甘膦具有非選擇性,在殺滅雜草的同時(shí)會(huì)對(duì)田間作物也造成傷害,所以通過(guò)分子育種途徑培育抗草甘膦作物是雜草防治的重要手段之一。通過(guò)將抗草甘膦的EPSPS基因?qū)胱魑?可獲得具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因品種。玉米(Zea mays.L)作為全球產(chǎn)量最大的的糧食作物,同時(shí)又是重要的飼料、經(jīng)濟(jì)和能源作物,在全世界廣泛種植。隨著抗性雜草的不斷產(chǎn)生,原有的除草劑使用效果欠佳,草害對(duì)玉米產(chǎn)量的影響愈發(fā)明顯,培育抗草甘膦玉米對(duì)于提高玉米產(chǎn)量和品質(zhì)有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)所用的抗草甘膦基因EPSPS來(lái)源于可變鹽單胞菌(Halomonas varabilis)(簡(jiǎn)稱H Var-EPSPS)。為了提高轉(zhuǎn)基因玉米的的草甘膦抗性,首先對(duì)H.Var-EPSPS基因序列依據(jù)玉米密碼子偏倚性進(jìn)行優(yōu)化,然后利用重疊延伸法對(duì)優(yōu)化后的cDNA序列進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得了兩個(gè)修飾的H.Var-EPSPS基因序列,即EPSPSM1和EPSPSM2。EPSPSM1是將第295位堿基由胸腺嘧啶(T)突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤(G),第299位堿基由鳥(niǎo)嘌呤(G)突變?yōu)榘奏?C),使其編碼的氨基酸序列發(fā)生變化。即第99位絲氨酸(Ser)突變?yōu)楸彼?Ala),100位甘氨酸(Gly)突變?yōu)楸彼?Ala)。EPSPSM2是在EPSPSMl的基礎(chǔ)上再將第292位堿基由鳥(niǎo)嘌呤(A)突變?yōu)樾叵汆奏?T),即將第98位天冬酰胺(Ash)突變?yōu)槔野彼?Tyr)。通過(guò)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),EPSPSM1和EPSPSM2在與底物結(jié)合的位點(diǎn)處構(gòu)象發(fā)生了變化。為了驗(yàn)證突變后的H.Var-EPSPS是否能提高轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦抗性,分別將EPSPSM1和EPSPSM2基因插入以玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子啟動(dòng)、水稻GluB5基因的3’UTR為終止子的表達(dá)插盒中,并將該插盒重組到以bar基因作為篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體中。其中bar為依據(jù)玉米密碼子偏倚性進(jìn)行過(guò)優(yōu)化的基因,由增強(qiáng)型CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng),以水稻GluB5基因的3’UTR終止。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米無(wú)菌幼苗莖尖轉(zhuǎn)化法,將兩個(gè)帶有目的基因的植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化入玉米骨干自交系昌7-2中,獲得了具有雙重除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因玉米植株。轉(zhuǎn)基因玉米的分子生物學(xué)驗(yàn)證首先利用PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米的bar基因和EPSPSM1或EPSPSM2基因,確定它們已整合到了玉米基因組。在T1代抗性植株檢測(cè)中,C72-M1的76株TO植株的自交后代中,有32個(gè)株系檢測(cè)到bar基因和EPSPSM1基因,陽(yáng)性率為42.1%；在C72-M2的70株T0植株自交后代中,有29個(gè)株系檢測(cè)到bar基因和EPSPSM2基因,陽(yáng)性率為41.4%。對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株自交結(jié)籽,通過(guò)逐代的除草劑篩選和PCR檢測(cè)獲得了轉(zhuǎn)基因純合的T3代植株。然后通過(guò)Western Blot的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因編碼產(chǎn)物EPSPSM1和PSPSM2在T3代轉(zhuǎn)基因植株中組成型表達(dá)。轉(zhuǎn)基因玉米的除草劑抗性鑒定在轉(zhuǎn)基因玉米除草劑抗性鑒定中,將本課題中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因玉米和未優(yōu)化的H. Var-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米、進(jìn)行過(guò)玉米密碼子偏倚性修飾的H.Var-EPSPS轉(zhuǎn)基因玉米同時(shí)進(jìn)行草甘膦處理,以確定基因突變的效果。在玉米植株4葉期時(shí)噴施有效成分為2.52 kg ae ha-1草甘膦,即田間標(biāo)準(zhǔn)使用劑量的3倍,觀測(cè)植株生長(zhǎng)狀況及成活率。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)培育的轉(zhuǎn)基因植株仍能保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài),即突變過(guò)的EPSPSM1或EPSPSM2確實(shí)提高了轉(zhuǎn)基因植株的草甘膦抗性。同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株還具有良好的草丁膦抗性,3葉期可耐0.412kg ae ha-1的草丁膦處理。我們獲得了兼抗兩種不同作用機(jī)制除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米純合系。在玉米田間雜草防治中,可以選擇性地噴施一種或兩種除草劑或噴灑混合除草劑溶液來(lái)控制雜草,不僅能高效控制草害,而且可有效推遲抗性雜草的進(jìn)化。本實(shí)驗(yàn)獲得的具有雙重除草劑抗性的的轉(zhuǎn)基因玉米,為培育我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗除草劑玉米品種奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Because of its high efficiency , broad spectrum , internal suction conduction type and low toxicity , it is one of the most widely used herbicides in agricultural production . In order to improve glyphosate resistance of transgenic maize , we firstly optimized the sequence of H . Var - EPSPS gene according to the bias of maize codon , and then mutated it to guanine ( G ) from guanine ( G ) by overlapping extension method .
The expression of EPSPSM1 and PSPSM2 in transgenic maize was detected by Western Blot . The results showed that the mutant EPSPSM1 or EPSPSM2 improved the glyphosate resistance of transgenic plants . The results showed that the mutant EPSPSM1 or EPSPSM2 improved the glyphosate resistance of transgenic plants .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S513

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 華水金;袁淑娜;邵明彥;倪密;王學(xué)德;蔣立希;祝水金;;抗草甘膦棉花研究進(jìn)展[J];分子植物育種;2007年04期

2 楊子山;;抗草甘膦大豆對(duì)抗草甘膦棉花的干擾作用[J];中國(guó)棉花;2009年11期

3 蘇少泉;抗草甘膦作物的創(chuàng)制與發(fā)展[J];世界農(nóng)業(yè);2004年03期

4 王宏偉;梁業(yè)紅;史振聲;張世煌;;作物抗草甘膦轉(zhuǎn)基因研究概況[J];作物雜志;2007年04期

5 蘇少泉;;抗草甘膦作物的發(fā)展與草甘膦使用中若干問(wèn)題[J];農(nóng)藥研究與應(yīng)用;2007年04期

6 葉萱;;草甘膦對(duì)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物病害的作用[J];世界農(nóng)藥;2008年04期

7 卜貴軍;劉洪梅;李英;崔琳;王學(xué)東;;草甘膦對(duì)大豆超微結(jié)構(gòu)及光合指標(biāo)影響的研究[J];電子顯微學(xué)報(bào);2008年04期

8 楊子山;;二代抗草甘膦棉田長(zhǎng)芒莧化除適期試驗(yàn)[J];中國(guó)棉花;2009年09期

9 蘇少泉;;轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物的新進(jìn)展[J];現(xiàn)代農(nóng)藥;2009年06期

10 朱元招;王鳳來(lái);尹靖東;;抗草甘膦大豆及豆粕營(yíng)養(yǎng)成分和抗?fàn)I養(yǎng)因子研究[J];營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2010年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 韓思寧;金龍國(guó);陶波;邱麗娟;;抗草甘膦真菌的分離及其抗性基因的表達(dá)[A];第23屆全國(guó)大豆科研生產(chǎn)研討會(huì)論文摘要集[C];2012年

2 劉東軍;張銳;孟志剛;郭紅媛;程海剛;王成社;郭三堆;;抗草甘膦基因突變體的克隆及表達(dá)[A];全國(guó)作物生物技術(shù)與誘變技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

3 劉東軍;張銳;孫國(guó)清;閆喜中;胡建斌;王成社;郭三堆;;抗草甘膦基因的克隆及其在在棉花中的表達(dá)[A];全國(guó)作物生物技術(shù)與誘變技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

4 魏守輝;李香菊;張朝賢;黃紅娟;崔海蘭;;抗草甘膦雜草發(fā)生現(xiàn)狀及轉(zhuǎn)基因大豆田草害治理策略[A];糧食安全與植�？萍紕�(chuàng)新[C];2009年

5 劉琦;李希臣;劉昭軍;雷勃鈞;;抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因漂移的研究[A];第五次全國(guó)植物分子育種代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2008年

6 楊兆光;劉亞平;肖遠(yuǎn)龍;;抗草甘膦棉花的雜種優(yōu)勢(shì)研究[A];中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2013年年會(huì)論文集[C];2013年

7 郝獻(xiàn)領(lǐng);李志強(qiáng);張敏;陳洪濤;張延忠;李澤田;;室內(nèi)對(duì)轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花品系鑒定方法[A];中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2013年年會(huì)論文集[C];2013年

8 頓保慶;金丹;梁愛(ài)敏;陸偉;林敏;;新型高抗草甘膦EPSP合酶基因的拆分和重建[A];2005熱帶亞熱帶微生物資源的遺傳多樣性與基因發(fā)掘利用研討會(huì)論文集[C];2005年

9 潘愛(ài)虎;張大兵;潘良文;陳家華;袁政;梁婉琪;;轉(zhuǎn)基因抗草甘膦油菜的實(shí)用PCR檢測(cè)方法[A];全國(guó)作物細(xì)胞工程與分子技術(shù)育種學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2003年

10 朱元招;李德發(fā);尹靖東;王鳳來(lái);;抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆PCR定量檢測(cè)研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2004學(xué)術(shù)年會(huì)暨第五屆全國(guó)畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 方舟子;神秘的“不明病原體”[N];新華每日電訊;2013年

2 本報(bào)記者 馬愛(ài)平;我國(guó)抗除草劑轉(zhuǎn)基因技術(shù)突破重圍[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

3 實(shí)習(xí)記者 江華;2，，4-滴展現(xiàn)新空間[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 趙特;一種抗草甘膦基因的發(fā)現(xiàn)和抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的培育[D];浙江大學(xué);2008年

2 金丹;新型高抗草甘膦EPSPS基因的克隆及草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)鑒定[D];四川大學(xué);2007年

3 燕樹(shù)鋒;轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系的創(chuàng)造及利用[D];浙江大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 黃潔瓊;農(nóng)桿菌活體轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)化與高抗草甘膦棉種質(zhì)的創(chuàng)制[D];浙江大學(xué);2016年

2 譚苗苗;轉(zhuǎn)g10evo基因抗草甘膦大豆的研究[D];浙江大學(xué);2016年

3 靳傳娣;可變鹽單胞菌EPSPS基因的突變和抗草甘膦玉米的培育[D];山東大學(xué);2016年

4 商璐;抗草甘膦大豆種質(zhì)挖掘及抗性機(jī)制研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

5 王秀英;來(lái)源于澳大利亞鏈球菌的高抗草甘膦aroA基因的克隆及酶學(xué)特性研究[D];上海師范大學(xué);2016年

6 劉吉燾;棉花抗草甘膦基因的初步定位及草甘膦誘導(dǎo)花粉不育的生理生化特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 李敬娜;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗草甘膦基因玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究[D];海南大學(xué);2010年

8 趙哲;轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆對(duì)草甘膦代謝產(chǎn)物（AMPA）的生理反應(yīng)[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

9 楚宗艷;棉花抗草甘膦基因的表達(dá)及功能鑒定[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

10 卜貴軍;草甘膦對(duì)大豆葉片生理和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：1953894