本文選題：轉基因煙草 + 玉米ZmPIS啟動子��； 參考：《山東大學》2014年碩士論文

【摘要】：土壤干旱和鹽漬化等嚴重限制了植物的生長發(fā)育,已成為影響作物品質和產量的重要因素。作物應對干旱和土壤鹽漬化不良環(huán)境,促進產量的生物學過程受到包含多個關鍵基因在內的協(xié)同調控過程。發(fā)掘并克隆耐逆關鍵功能基因及調節(jié)元件,采用轉基因技術培育抗旱、耐鹽作物新品種,是解決上述問題的有效途徑。目前,利用植物基因工程手段改良作物相關性狀時,轉化的目標基因在植物宿主細胞中的高效表達和組織或時空特異性等受到越來越多的關注�；虻谋磉_調控是在DNA水平、轉錄水平、翻譯及翻譯后修飾水平等多層次協(xié)同調控的過程,其中轉錄水平的調控主要是通過啟動子上的順式作用元件與反式作用因子的相互作用來實現(xiàn)功能基因在特定的時間、組織中表達。分離克隆可用于作物抗逆遺傳改良的啟動子并獲得自主知識產權,了解各啟動子中的核心功能區(qū)段及調控元件的功能基礎具有重要的理論意義和應用價值。在實驗室前期工作中,翟淑梅等發(fā)現(xiàn)玉米ZmPIS基因具有明顯的鹽和干旱等脅迫誘導特性。官贊贊等克隆了ZmPIS基因的啟動子序列并初步確定了該啟動子啟動目的基因表達的能力。本工作在上述工作基礎上對ZmPIS基因的啟動子的功能及脅迫響應特性進行了系統(tǒng)地分析。ZmPIS基因啟動子的生物信息學分析表明該啟動子含有多個脅迫響應元件。我們構建了該啟動子的5’端系列缺失突變植物表達載體PZ1-PZ8,啟動Gus報告基因的表達,轉化煙草。對含有啟動子不同長度片段的轉基因煙草葉片進行了GUS熒光活性測定,發(fā)現(xiàn)PZ7在PZ1-PZ8轉基因煙草葉片材料中表現(xiàn)出了最高的啟動目的基因表達的能力。以PZ1、PZ7和35S啟動子轉基因煙草2周齡植株及花、果、種子進行GUS組織化學染色,發(fā)現(xiàn)PZ7相對于PZ1全長啟動子在上述不同組織器官中均具有更高的GUS表達強度。為進一步研究ZmPIS啟動子脅迫響應特性,我們對PZ1-PZ8轉基因煙草進行了NaCl和18% PEG等脅迫處理分析。轉基因煙草離體葉片在200mMNaCl、18% PEG處理下的GUS組織化學染色結果表明,鹽和滲透脅迫下PZ1-PZ7有相似的誘導表達模式,即處理1 h、3 h、6 h時與未處理的對照相比無顯著差異,12 h時表現(xiàn)出一定誘導趨勢,處理至24 h、48 h和72 h時GUS染色強度顯著上調,且PZ7在脅迫誘導前后均具有最高GUS表達強度。相對而言PZ8和35S啟動子在上述兩種脅迫環(huán)境下均未表現(xiàn)出明顯的誘導表達變化。為進一步驗證上述離體實驗的結果,我們以PZ1、PZ2、PZ6、PZ7、PZ8、35S轉基因煙草活體植株為材料開展了相應的NaCl和PEG脅迫處理實驗。GUS組織化學染色及熒光活性測定結果表明,處理24 h時PZ1、PZ2、PZ6和PZ7轉基因煙草中的GUS酶活性達到最高(均達到處理前的2倍以上),且在處理48 h和72 h時一致保持較高的誘導水平,也就是說PZ1-PZ7均具有明顯的高鹽和滲透脅迫誘導活性,而PZ8的高鹽和滲透脅迫誘導活性卻明顯喪失。值得注意的是PZ7在脅迫前后與其它突變體材料相比均體現(xiàn)出了最高啟動活性,可達到PZ1(全長啟動子)的20倍以上,PZ6的3倍以上。正常條件下PZ7的啟動表達活性為PZ8的1.1倍左右和35S啟動子的20%左右；而鹽和滲透脅迫后可達到PZ8的2倍以上和35S啟動子50%左右。上述結果意味著PZ7-PZ8缺失的110 bp片段(-466到-357 bp)中可能含有高鹽和滲透脅迫響應元件,且PZ7(-466 bp片段)為ZmPIS啟動子具有鹽和滲透脅迫響應特性的高效啟動基因表達的關鍵序列區(qū)段,體現(xiàn)出了一定的應用潛質。本工作通過對玉米ZmPIS啟動子的功能及脅迫響應特性分析,發(fā)現(xiàn)了PZ7(-466 bp)片段為該啟動子具有鹽和滲透脅迫響應活性的高效啟動基因表達的核心功能區(qū)段,而-466 bp到-357 bp之間的110 bp序列可能存在鹽和滲透脅迫響應順式作用元件。這些實驗結果加深了我們對玉米ZmPIS基因啟動子上核心功能區(qū)段及脅迫響應特性的了解,為作物抗逆基因工程育種提供了一定的啟動子資源和參考資料,有望為我國作物抗逆遺傳改良貢獻自己的綿薄之力。
[Abstract]:Soil drought and salinization have seriously restricted the growth and development of plants. It has become an important factor affecting the quality and yield of crops. The biological process of crop response to drought and soil salinization and the biological process of promoting yield are coordinated by several key genes. The use of transgenic technology to cultivate drought resistant and salt tolerant crop varieties is an effective way to solve the above problems. At present, more and more attention has been paid to the efficient expression and tissue or time space specificity of the target gene in plant host cells by using plant genetic engineering methods to improve crop correlation. Regulation is a multi level coordination process, such as DNA level, transcriptional level, translation and post-translational modification. The regulation of transcriptional level is mainly through the interaction of the cis acting element and the trans acting factor on the promoter to realize the functional genes in a specific time and tissue. The isolated clones can be used for crop resistance. In the early work of the laboratory, Zhai Shumei found that the maize ZmPIS gene had obvious salt and drought stress induction characteristics. The promoter sequence of the ZmPIS gene was augmentation and the ability of the promoter to start the gene expression was preliminarily determined. On the basis of the above work, a systematic analysis of the biological information of the promoter of the.ZmPIS gene was carried out on the basis of the function of the promoter of the ZmPIS gene and the response characteristics of the promoter, and it was shown that the promoter contains multiple stress responses. Components. We constructed a 5 'terminal series deletion mutant plant expression vector PZ1-PZ8, started the expression of Gus reporter gene and transformed tobacco. The GUS fluorescence activity of transgenic tobacco leaves with different lengths of promoter was measured. It was found that PZ7 showed the highest start in the PZ1-PZ8 transgenic tobacco leaf material. The ability of the target gene expression. The 2 weeks old plants of PZ1, PZ7 and 35S promoters, flowers, fruits and seeds were stained with GUS histochemical staining. It was found that PZ7 had a higher GUS expression intensity in the different tissues and organs of the PZ1. To further study the response characteristics of the ZmPIS promoter stress, we had the PZ1-PZ8 transgene. The NaCl and 18% PEG stress treatments of tobacco were analyzed. The GUS histochemical staining results of the leaves of transgenic tobacco under the treatment of 200mMNaCl and 18% PEG showed that the PZ1-PZ7 had similar induced expression patterns under salt and osmotic stress, that is, the treatment of 1 h, 3 h, 6 h was not significantly different from that of the untreated, while 12 h showed a certain inducement. The guiding trend, when treated to 24 h, 48 h and 72 h, the GUS staining intensity was significantly up-regulated, and PZ7 had the highest GUS expression intensity before and after stress induction. Relatively speaking, PZ8 and 35S promoter did not show obvious inducible expression changes under these two stress environments. The Z8,35S transgenic tobacco living plants carried out the corresponding NaCl and PEG stress treatment experiments. The results of histochemical staining and fluorescence activity of.GUS showed that the activity of GUS enzyme in PZ1, PZ2, PZ6 and PZ7 transgenic tobacco reached the highest when treating 24 h (all reached more than 2 times before the treatment), and remained high in the treatment of 48 h and 72 h. The induction level, that is, PZ1-PZ7 has obvious high salt and osmotic stress induction activity, while the high salt and osmotic stress induced activity of PZ8 is lost obviously. It is worth noting that PZ7 shows the highest activation activity compared with other mutant materials before and after stress, and can reach more than 20 times of PZ1 (full promoter), and 3 times of PZ6. Above. Under normal conditions, the activation of PZ7 is about 1.1 times of PZ8 and about 20% of 35S promoter, while salt and osmotic stress can reach more than 2 times of PZ8 and 50% of 35S promoter. The above results mean that the 110 BP fragments of PZ7-PZ8 deletion (-466 to -357 BP) may contain high salt and osmotic stress response elements, and PZ7 (-466) Fragment) is the key sequence section of high efficient promoter gene expression of ZmPIS promoter with salt and osmotic stress response characteristics, reflecting certain application potential. This work has found that PZ7 (-466 BP) fragment has salt and osmotic response activity through the analysis of the function and stress response characteristics of maize ZmPIS promoter. The 110 BP sequences between -466 BP and -357 BP may have salt and osmotic response cis elements. These results deepen our solution to the core functional areas and stress response characteristics of the maize ZmPIS promoter, and provide the crop resistant genetic engineering breeding. Certain promoter resources and reference materials are expected to contribute to the improvement of crop genetic resistance in China.

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q943.2

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本文編號：1797968