本文選題：cRGD-siRNA　切入點：腫瘤靶向性　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 siRNA,作為RNAi中重要組成部分,基于天然的細胞內(nèi)基因沉默功能和降低靶基因表達的強有力工具,使其成為一種具有重大研究前景的新型治療策略。目前已被廣泛用于各種疾病治療的基礎(chǔ)研究。作為一種新興的治療技術(shù),以一種前所未有的速度邁進了臨床試驗階段。任何與疾病有關(guān)的表達基因都是潛在的靶標(biāo),從家族遺傳疾病到腫瘤,再到病毒感染等。然而面臨的一些亟待解決的問題限制了其在臨床中的應(yīng)用,包括siRNA分子在體內(nèi)的穩(wěn)定性,靶向于特定的組織/器官和潛在的非特異性(如脫靶作用和免疫反應(yīng))等。siRNA分子在體內(nèi)的穩(wěn)定性和特異性通過各種化學(xué)修飾已得到解決。雖然分子量大(～13KD)和強的負電荷是阻礙治療分子siRNA有效地在體內(nèi)發(fā)揮作用的最大障礙。但是目前各種對siRNA分子的修飾,包括將siRNA裝配進陽離子聚合物和脂質(zhì)體中形成納米粒、整合到外合體中、和各種肽(抗體或核酸結(jié)合區(qū)域)結(jié)合形成復(fù)合物,以及siRNA分子共軛連接于肽轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域、細胞特異性適體、受體特異性配體等這些措施有效地解決了這一難題,多種以RNAi為基礎(chǔ)的藥物也已進入臨床試驗。 目前siRNA分子系統(tǒng)體內(nèi)應(yīng)用的最關(guān)鍵問題是設(shè)計制備合適的給藥系統(tǒng),突破細胞膜障礙,提高轉(zhuǎn)染效率,靶向進入深層組織和細胞,使siRNA分子更像一種藥物分子,選擇合適的給藥系統(tǒng)是臨床應(yīng)用siRNA分子的最大瓶頸。因此,為了臨床疾病的治療目的,需要大力研制能靶向性進入組織和器官的siRNA給藥系統(tǒng),以改善siRNA分子的靶向性,提高轉(zhuǎn)染效率,發(fā)揮最大的療效和減少副作用。 整合素αvβ3在血管生成和腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用,而且在腫瘤血管和各種侵襲性腫瘤細胞中整合素αvβ3的表達都明顯升高,而在正常的靜止期內(nèi)皮細胞和組織中表達量較低,幾乎不表達。而大量研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的整合素αvβ3和RGD肽具有高度的親和能力。且RGD修飾的納米粒或蛋白等等都可以選擇性進入高表達αvβ3的細胞或組織。 在腫瘤形成早期由于腫瘤組織低氧環(huán)境、癌基因激活以及代謝性應(yīng)激的誘導(dǎo),使得成熟血管休眠期被打破,促血管新生因子表達上調(diào),發(fā)生血管新生。血管新生不僅在生長、繁殖、修復(fù)等過程中起著重要的作用,同時也對腫瘤形成、轉(zhuǎn)移及其它許多非腫瘤疾病起決定性作用。如果沒有血管的營養(yǎng)、血液以及氧的供給,腫瘤只能生長1-2mm,因而抑制血管新生為抑制腫瘤的關(guān)鍵,抑制血管新生相關(guān)信號通路為抗腫瘤熱門靶點。VEGF/VEGFR2通路在腫瘤血管新生中起關(guān)鍵作用,血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)和其相關(guān)的受體(VEGFRs)參與調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育中前體細胞中的血管發(fā)育,到后期預(yù)先存在的血管中新生血管的形成。在實體瘤中,VEGF主要由腫瘤細胞生成,VEGF和VEGFR2結(jié)合進一步激活腫瘤血管多種重要的細胞通路。因此,有效地抑制腫瘤血管的生成,可抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。利用siRNA分子抑制VEGFR2的表達,可以達到治療腫瘤的口的。 本研究中,我們研制了一種具有自主知識產(chǎn)權(quán)、能容易產(chǎn)業(yè)化的靶向腫瘤新生血管及腫瘤細胞的siRNA給藥系統(tǒng)：cRGD-siRNA分子；經(jīng)血管途徑給藥后可介導(dǎo)各種siRNA分子進入腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞及多種腫瘤細胞,沉默靶基因的表達,發(fā)揮siRNA分子的生物學(xué)功能。 目的 1.合成cRGD-siRNA分子并且對其結(jié)構(gòu)進行鑒定。 2.體外研究cRGD-siRNA分子的細胞靶向性,細胞毒性以及基因沉默功能。 3.研究cRGD-siRNA分子抑制斑馬魚的血管生成作用。 4.體內(nèi)腫瘤組織靶向性研究：經(jīng)血管途徑給藥后不同時間,cRGD-siRNA分子在腫瘤裸鼠體內(nèi)的腫瘤靶向性以及在體內(nèi)的動態(tài)分布。 5.cRGD-siRNA分子的抑瘤生物學(xué)功能及其機制研究：研究系統(tǒng)途徑連續(xù)給予cRGD-siRNA分子的抗腫瘤生長的生物學(xué)功能,及其機制(血管生成抑制、基因沉默、腫瘤細胞凋亡)；同時通過ELISA和血液化學(xué)檢測體內(nèi)給予cRGD-siRNA分子后的免疫刺激和毒副作用。 方法 1.制備cRGD-siRNA分子 用環(huán)狀cRGD肽通過巰基與siRNA分子正義鏈的3’端共軛連接,用高效液相色譜(HPLC)對純化后的cRGD-siRNA分子進行測定,cRGD-sense siRNA分子的分子量通過質(zhì)譜分析進行測定。同時,選擇陰性對照肽cRAD通過巰基與siRNA分子正義鏈的3’端共軛連接,得到cRAD-siRNA分子作為陰性對照分子。 2.cRGD-siRNA分子體外功能研究 采用CCK-8檢測方法評價cRGD-siRNA分子的體外細胞毒性。通過共聚焦顯微鏡檢測Cy5標(biāo)記siRNA分子在細胞中的分布,來驗證cRGD-siRNA分子靶向性進入整合素αvβ3表達細胞的能力。采用RT-qPCR和western blot分別從mRNA和蛋白水平評價cRGD-siRNA分子在細胞中的基因沉默功能。用One Way ANOVA進行統(tǒng)計學(xué)分析；根據(jù)方差是否齊性選擇LSD或者Dunnett T3檢驗,比較各組之間差異顯著性 3. cRGD-siRNA分子抑制斑馬魚血管生成的研究 本研究選用野生型斑馬魚和flk1-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚做為模型生物。在顯微鏡下挑選發(fā)育良好的斑馬魚胚胎(5hpf),放入6孔板中,每孔20個。通過顯微注射將cRGD-siRNA (zVEGFR2,100μM,2nl), zVEGFR2(100u M,2nl), cRGD(2mg/ml,2nl)或ddH20(2nl)注射進5hpf的斑馬魚胚胎。然后置于28.5℃孵育,至24hpf和72hpf,分別采用熒光倒置顯微鏡和共聚焦顯微鏡檢測血管發(fā)育狀況。采用相對熒光密度對cRGD-siRNA給藥后在斑馬魚體內(nèi)對血管抑制情況進行定量。以Adobe Photoshop7.0軟件記錄多層掃描投射熒光集合(Z-stack Projection)。以灰度平均值記為熒光亮度,結(jié)果以各組熒光亮度與對照組之比進行統(tǒng)計分析。相對熒光密度以ddH20處理組進行標(biāo)化。 4.系統(tǒng)給藥后cRGD-siRNA分子在體內(nèi)的腫瘤靶向性及分布研究。 cRGD-siRNA分子和裸siRNA分子經(jīng)尾靜脈給藥后,通過小動物活體成像系統(tǒng)IVIS Spectrum (Xenogen)檢測在腫瘤裸鼠體內(nèi)的分布。當(dāng)腫瘤體積達到約40-60mmm3時,首先用底物D-Luciferin對腫瘤(A549-1uc+細胞,表達luciferase)進行定位,然后給予lnmol Cy5標(biāo)記cRGD-siRNA分子和Cy5標(biāo)記的裸siRNA分子,接著采用小動物活體成像儀檢測30min到24h中不同時間點,Cy5標(biāo)記cRGD-siRNA分子和裸siRNA分子在腫瘤裸鼠中的分布。24h后,處死小鼠,取出腫瘤以及各個器官進行成像。同時采用Cy5標(biāo)記cRAD-siRNA分子作陰性對照。 5.cRGD-siRNA分子的抑瘤生物學(xué)功能及其機制研究。 對裸鼠皮下接種5×106個A549一luc+人非小細胞肺癌細胞以建立腫瘤模型,每隔三天測量小鼠體重及腫瘤體積。腫瘤體積以游標(biāo)卡尺測量,計算公式為1/2×a×b2,其中a代表長直徑,b代表短直徑。待腫瘤長至40-60mm3,將荷瘤小鼠隨機分組。每組小鼠尾分別靜脈注射給予1nM cRGD-siRNAl (~0.753mg/kg; n=8),1nM cRGD-siRNA2(~0.753mg/kg; n=5),1nM cRAD-siRNA2(~0.753mg/kg; n=5), cRGD alone (~0.045mg/kg; n=5),1nM cRGD-si β-actin (~0.753mg/kg; n=5), cRGD-control siRNA (~0.753mg/kg; n=5)或生理鹽水(n=10),終體積為150μL。每隔兩天給予一次,共6次。腫瘤體積在每次給藥前進行測定�；蛟谔囟ǖ臅r間點,通過小動物活體成像系統(tǒng)IVIS Spectrum (Xenogen)檢測腫瘤細胞的熒光強度。應(yīng)用單因素重復(fù)測量方差分析比較給藥各組腫瘤體積是否有統(tǒng)計學(xué)差異。并繪制腫瘤生長曲線和熒光表達曲線比較各組腫瘤生長是否存在差異。最后一次給藥后48h,進行水合氯醛麻醉,眼球采血和剝離腫瘤組織,對腫瘤組織拍照后立即投入液氮以備RNA及蛋白提取分析。分離血清,通過ELISA檢測細胞因子IFN-α,IFN-γ,IL-6和IL-12的表達量。全自動血液分析儀檢測血清中ALT和Cr含量。免疫組化檢測腫瘤組織切片中CD31的表達量。TUNEL檢測腫瘤組織切片中細胞凋亡。用ANOVA對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果 1.鑒定制備的cRGD-siRNA分子 本課題制備并鑒定獲得了cRGD-siRNAl(小鼠VEGFR2)、cRGD-siRNA2(小鼠VEGFR2)、cRAD-siRNA(小鼠VEGFR2)、cRGD-control siRNA(隨機設(shè)計供對照)、cRGD-siRNAl (人VEGFR2)、cRGD-siRNA2(人VEGFR2)、cRAD-siRNA2(人VEGFR2)。典型cRGD-siRNA分子的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1-1A所示。HPLC測定純化后cRGD-siRNA分子的含量高于90%,質(zhì)譜測定cRGD-siRNA分子正義鏈的分子量為7975.3與預(yù)測的分子量7977.9相一致。20%SDS-PAGE凝膠電泳后,用花青染料SYBR Gold染色,結(jié)果顯示cRGD-siRNA分子與裸siRNA分子相比有遲滯現(xiàn)象。 2.cRGD-siRNA分子體外功能 (1)在37℃孵育24h后,經(jīng)過cRGD-siRNA和control siRNA(cRGD-NC-siRNA)處理后的細胞生長率分別為96.5%和96.0%,而陽性對照(Lipofectamine2000)/siRNA復(fù)合物為75.2%(P=0.000)。 (2)共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示在HUVEC細胞中存在大量Cy5標(biāo)記的cRGD-siRNA分子,而在整合度αvβ3特異性抗體和cRGD肽封閉后轉(zhuǎn)染的HUVEC細胞中無Cy5標(biāo)記的cRGD-siRNA分子。cRAD肽封閉后轉(zhuǎn)染的HUVEC細胞中也存在大量Cy5標(biāo)記的cRGD-siRNA分子。但Cy5標(biāo)記的cRAD-siRNA分子卻不能進入HUVEC細胞中。 (3) qPCR結(jié)果顯示經(jīng)cRGD-siRNA1及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的siRNAl分子沉默靶基因分別為80%及75%,二者間有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.022);Western blot研究表明,二者抑制靶蛋白分別為80%及70%,二者間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.522)。cRGD-siRNA2分子沉默靶基因為66%,與對照組相比有顯著差異(P=0.000);cRGD-siRNA2分子沉默靶蛋白為75%,與對照組相比有顯著差異(P=0.009)。 3.cRGD-siRNA分子可抑制斑馬魚血管的發(fā)育。 通過激光共聚焦顯微鏡觀測了cRGD-siRNA VEGFR2分子對斑馬魚軀干部血管的影響。選擇觀察這一區(qū)域,是因為相比頭面部血管,軀干部血管比較簡單和規(guī)則,對這些血管的研究也比較透徹。斑馬魚胚胎中αv β3受體在48hpf開始表達,而斑馬魚胚胎發(fā)育中主要的血管,包括DA和腹側(cè)靜脈血管在24hpf完全發(fā)育。而新生血管主要在24hpf和72hpf之間發(fā)育。因此我們選擇24h和72作為觀測時間點。在給藥處理后24hpf,通過熒光顯微鏡檢測cRGD-siRNA和siVEGFR2處理組軀干血管發(fā)育受到抑制,但沒有明顯的差異。然而在72hpf,與ddH20處理組相比,cRGD-siRNA組斑馬魚的新生血管發(fā)育明顯受到抑制,而且相對熒光強度的表達量約為48.8%,有顯著差異(P=0.000)。在實驗中發(fā)現(xiàn)因血管異常發(fā)育而導(dǎo)致畸形斑馬魚,及死亡的斑馬魚。 4.系統(tǒng)給藥后cRGD-siRNA分子在體內(nèi)的腫瘤靶向性及分布 經(jīng)尾靜脈給予熒光標(biāo)記(Cy5)cRGD-siRNA分子后30min到24h內(nèi),通過小動物活體成像儀檢測均可發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的熒光分布；而經(jīng)尾靜脈同樣給予Cy5標(biāo)記的裸siRNA分子組在腫瘤部位未檢測到熒光,主要存在于腎臟和肝臟。解剖后裸鼠的各個器官和腫瘤組織成像后的結(jié)果和活體成像的結(jié)果相一致。Cy5標(biāo)記的cRAD-siRNA分子組在腫瘤部位也未檢測到熒光,主要存在于腎臟和肝臟。 5.cRGD-siRNA分子的抑瘤生物學(xué)功能及其作用機制 每隔兩天經(jīng)尾靜脈給予荷瘤小鼠一次cRGD-siRNAl(小鼠VEGFR2),共6次。在各個時間點測定腫瘤的體積和腫瘤內(nèi)熒光強度。最后一次給藥后48h,處死小鼠,并取出腫瘤組織。進行RT-qPCR和western blot測定VEGFR2的mRNA和蛋白的表達量,表達量分別為均49.1%和42.2%,均存在顯著差異(P=0.000和P=0.000)。VEGFR2的降低,反過來導(dǎo)致腫瘤的生長受到抑制(P=0.000),而腫瘤的熒光信號強度降低90%, P=0.000。同時,cRGD-siRNA2(小鼠VEGFR2)也有相似的藥理學(xué)作用：mRNA水平的表達降低約45%,有顯著差異(P=0.000),蛋白水平的表達降低65%,有顯著差異(P=0.000),以及腫瘤體積的顯著減小(P=0.000)和腫瘤內(nèi)熒光強度的減弱約70%,P=0.005。不同序列的siRNA分子的結(jié)果進一步證實了沉默效能的序列特異性。TUNEL檢測結(jié)果顯示了cRGD-siRNA組腫瘤細胞凋亡的數(shù)量明顯高于對照組cRAD-siRNA和生理鹽水。而免疫組化分析的結(jié)果顯示：與對照組cRAD-siRNA和生理鹽水相比,由于VEGFR2的表達降低,cRGD-siRNA組中CD31的密度也明顯降低。而在給藥后6h和24h,和對照組相比,cRGD-siRNA組細胞因子IFN-α,IFN-γ, IL-6和IL-12,均沒有表達量明顯升高的差異。此外,與對照組相比,cRGD-siRNA組中肌酐和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶無統(tǒng)計學(xué)差異,P=0.890和P=0.930。在cRGD-siRNA組和其他組中經(jīng)過16天的治療,并無死亡和體重降低的情況發(fā)生。 結(jié)論： 1.環(huán)狀RGD寡肽及對照RAD寡肽通過linker巰基-馬來酰胺與siRNA分子正義鏈的3’端相連,經(jīng)電泳及核磁鑒定成功合成了cRGD-siRNA分子。 2.cRGD-siRNA分子沒有明顯的細胞毒性。 3.cRGD-siRNA分子可以特異性進入表達整合素αvβ3的細胞中,提示該分子可經(jīng)受體介導(dǎo)進入細胞；并有效沉默靶基因的表達,與脂質(zhì)體介導(dǎo)的細胞攝入siRNA分子的沉默效率沒有差異。 4.cRGD-siRNA分子(靶向斑馬魚VEGFR2)可能通過整合素αvβ3受體介導(dǎo),可以有效地抑制斑馬魚胚胎新生血管生成。 5. cRGD寡肽修飾的siRNA分子(cRGD-siRNA)經(jīng)小鼠尾靜脈給藥后,可靶向性分布于腫瘤部位,進入新生血管內(nèi)皮細胞內(nèi),并介導(dǎo)靶基因的沉默。 6.cRGD-siRNA(小鼠VEGFR2)可抑制腫瘤的生長,且該生物學(xué)活性是通過沉默腫瘤相關(guān)基因的表達(VEGFR2)、抑制抗腫瘤部位新生血管的生成、及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等機制實現(xiàn)的。 7.實驗期間體內(nèi)應(yīng)用cRGD-siRNA分子無免疫刺激、無明顯的肝腎毒性,具有良好的耐受性。 8.cRGD-siRNA分子具有臨床治療腫瘤的應(yīng)用前景。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R73-36

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 郎楠;劉明;唐秋琳;;microRNA-29s對胃癌細胞增殖和侵襲的作用(英文)[J];癌癥;2010年06期

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本文編號：1604185