本文選題：miniSTR　切入點(diǎn)：復(fù)合擴(kuò)增　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的:miniSTR技術(shù)即在設(shè)計(jì)引物時(shí),使其結(jié)合在更靠近核心重復(fù)序列的區(qū)域,PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物就會比STR基因座更短一些,可提高高度降解檢材的檢測成功率。大量研究證實(shí),miniSTR檢測技術(shù)對于高度降解檢材是很有效的一種手段。2006年美國AB公司研制開發(fā)了minifiler試劑盒,目前已被應(yīng)用到實(shí)際案件的分析中。但minifiler試劑盒僅包含8個(gè)CODIS系統(tǒng)(DNA聯(lián)合索引系統(tǒng))內(nèi)的STR基因座,其系統(tǒng)效能不足以進(jìn)行個(gè)人識別及親緣關(guān)系鑒定。因此,為了研究更多的miniSTR基因座,并為研制國產(chǎn)化試劑盒做準(zhǔn)備,本實(shí)驗(yàn)室自2005年以來研究了Hill等[1]報(bào)道的26個(gè)非CODIS系統(tǒng)miniSTR基因座在中國漢族人群的群體遺傳學(xué)特征,并從中篩選出12個(gè)多態(tài)性較好的基因座用于研發(fā)復(fù)合分型試劑盒,目前已經(jīng)成功構(gòu)建了兩組共包括8個(gè)miniSTR基因座的復(fù)合分型體系。本研究在我實(shí)驗(yàn)室既往成果的基礎(chǔ)上繼續(xù)構(gòu)建第三組miniSTR復(fù)合分型系統(tǒng),包括D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017四個(gè)miniSTR基因座,用分子克隆的技術(shù)制備其等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物,調(diào)查四個(gè)基因座在中國漢族及回族人群中的遺傳多態(tài)性,并探討其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。 方法:采用Chelex-100法提取135份中國漢族和114份中國回族無關(guān)健康個(gè)體全血基因組DNA。利用熒光復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017四個(gè)miniSTR基因座,ABI 310/3130基因分析儀對產(chǎn)物進(jìn)行檢測,Genemapper3.2軟件分析結(jié)果。根據(jù)電泳結(jié)果對反應(yīng)體系中的引物濃度、Mg2+濃度、DNA模板量、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化,以獲得最佳反應(yīng)條件。用構(gòu)建的復(fù)合體系對所有樣本的四個(gè)miniSTR基因座進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增。 根據(jù)所有樣本的群體遺傳學(xué)研究結(jié)果,應(yīng)用分子克隆技術(shù)制備四個(gè)基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物,并按照國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(international society of forensic genetics, ISFG)推薦的命名原則對各等位基因進(jìn)行命名。根據(jù)構(gòu)建的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物及測序結(jié)果對所有樣本復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等位基因命名,計(jì)算各基因座等位基因頻率及法醫(yī)學(xué)參數(shù)。 對構(gòu)建的熒光標(biāo)記miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行靈敏度、腐敗降解檢材DNA檢測能力的研究,并與商品化STR試劑盒進(jìn)行比較。 結(jié)果:本研究成功建立了熒光標(biāo)記miniSTR復(fù)合擴(kuò)增體系,并用分子克隆技術(shù)制備了miniSTR基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。利用該分型體系進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn):D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017基因座在135份中國漢族無關(guān)個(gè)體中分別檢出7、8、6、6個(gè)等位基因和14、18、14、14種基因型;在114份中國回族無關(guān)個(gè)體中分別檢出6、7、5、7個(gè)等位基因和15、23、13、17種基因型。基因型頻率分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。四個(gè)基因座在中國漢族人群的雜合度觀察值(Ho)依次為0.748、0.711、0.748、0.659;在中國回族人群依次為0.759、0.706、0.714、0.804。在中國漢族人群的多態(tài)信息含量(PIC)依次為0.68、0.66、0.67、0.64;在中國回族人群依次為0.70、0.73、0.69、0.68。在中國漢族人群的非父排除率(PE)依次為0.507、0.446、0.507、0.368;在中國回族人群依次為0.525、0.438、0.451、0.606。在中國漢族人群的個(gè)人識別力(DP)依次為0.874、0.871、0.862、0.851;在中國回族人群依次為0.884、0.911、0.880、0.860。四個(gè)miniSTR基因座的累積非父排除率在中國漢族人群為0.914902,在中國回族人群為0.942257;累積個(gè)人識別力在中國漢族人群為0.999666,在中國回族人群為0.999827。系統(tǒng)靈敏度研究:本研究構(gòu)建的miniSTR復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)對0.0625ng的DNA仍可進(jìn)行四個(gè)基因座的正確分型。腐敗降解檢材研究:結(jié)果顯示對降解五個(gè)月的血液檢材DNA和用DNase I消化25min的DNA,應(yīng)用miniSTR復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)分析在四個(gè)基因座中均得到了完整分型,顯示了miniSTR技術(shù)比常規(guī)STR試劑盒對降解檢材具有更高的分型成功率。 結(jié)論:本研究成功建立了四個(gè)miniSTR基因座D6S474、D20S482、D4S2408和D6S1017的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系并應(yīng)用分子克隆技術(shù)制備了四個(gè)基因座的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。將自制的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物應(yīng)用于中國漢族和回族人群的群體遺傳學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)四個(gè)基因座具有較好的遺傳多態(tài)性。本實(shí)驗(yàn)建立的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系分型結(jié)果準(zhǔn)確,靈敏度達(dá)0.0625ng,對于分析微量、降解檢材的成功率較常規(guī)STR試劑盒明顯提高,可用于法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定與個(gè)人識別,特別適合用于高度腐敗降解檢材的DNA檢測,可作為常規(guī)STR試劑盒的補(bǔ)充,提高系統(tǒng)效能,同時(shí)為開發(fā)國產(chǎn)化miniSTR試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective : To study the genetic polymorphism of miniSTR loci in Chinese Han population and to investigate the genetic polymorphism of miniSTR loci in Chinese Han population and to investigate the application value of miniSTR loci in Chinese Han and Hui people .


Methods : The whole blood genomic DNA of 135 Chinese Han people and 114 Chinese Hui people were extracted by Chelex - 100 method . Four miniSTR loci D6S474 , D20S482 , 4S2408 and D6S1017 were amplified by fluorescent compound amplification technique . The results of Genemapper3.2 software were optimized . The primers concentration , Mg2 + concentration , DNA template amount , annealing temperature and number of cycles were optimized . The four miniSTR loci of all samples were amplified by PCR .


According to the results of population genetics research of all samples , the allelic typing criteria of four loci were prepared by molecular cloning technique , and the alleles were named according to the nomenclature recommended by international society of genetics , ISFG . The allele frequencies and forensic parameters of each locus were calculated according to the constructed allele typing standard and sequencing results .


The sensitivity of the constructed fluorescent label miniSTR multiplex amplification system was studied , and the DNA testing ability of the samples was investigated and compared with the commercialized STR kit .


Results : In Chinese Han population , there were 0 . 7 , 0 . 1 9 , 0 . 7 , 0 .


Conclusion : Four miniSTR loci D6S474 , D20S482 , 4S2408 and D6S1017 have been successfully constructed and the allelic typing standard of four loci was prepared by molecular cloning . The results showed that the results were accurate and the sensitivity was 0.0625 ng .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：D919

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本文編號：1697096