第一章研究背景

短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeats，STRs)廣泛分布于人類基因組中，重復(fù)序列為2~6bp,重復(fù)次數(shù)從數(shù)次到數(shù)十次不等，其片段長度大多在400bp以下。STRs基因座以高靈敏度、高特異性以及標(biāo)準(zhǔn)化分型等特點(diǎn)成為了目前法醫(yī)DNA分析中的主要遺傳標(biāo)記[1]。最早發(fā)現(xiàn)的STR序列是由TG串聯(lián)重復(fù)組成的長度可變序列。絕大多數(shù)STR序列位于非編碼區(qū)，極少數(shù)分布在基因組的編碼區(qū)域。STR擴(kuò)增片段長度一般為100bp-400bp之間，聯(lián)合檢測：10-13個(gè)STR基因座，平均匹配概率可以達(dá)到10-9,具有很高的個(gè)體識(shí)別能力。從實(shí)際應(yīng)用價(jià)值來看，用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的STR基因座應(yīng)具備擴(kuò)增長度相對(duì)較短，較高的雜合度，有規(guī)律的4個(gè)或5個(gè)核苷酸重復(fù)，突變率低以及高度種屬特異性等特點(diǎn)。在大多數(shù)法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的實(shí)際案件中，所得到的現(xiàn)場檢材往往很多都已腐敗，甚至是高度腐敗，在此類法醫(yī)學(xué)檢材中DNA分子受到損害，DNA鏈發(fā)生斷裂，使DNA分子的完整性受到極大破壞。應(yīng)用STRs分型會(huì)出現(xiàn)基因漏擴(kuò)或優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增等現(xiàn)象，影響最終的分型結(jié)果，從而給法醫(yī)學(xué)實(shí)際應(yīng)用帶來極大的困難。
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第二章在痕量DNA中SNaPshot檢測ABO血型方法的構(gòu)建與優(yōu)化

2.1材料和方法
在案件缺乏足夠信息使得偵破工作陷入停頓時(shí)，通過法醫(yī)物證學(xué)相關(guān)的技術(shù)手段分析與表型相關(guān)的DNA突變，進(jìn)而獲得與表型相關(guān)的體征信息，可以有效地縮小拉網(wǎng)式排查范圍，為案件的早日突破提供積極的幫助。ABO血型是重要的人類遺傳表征，在法醫(yī)物證研究領(lǐng)域作為第一代常規(guī)法醫(yī)學(xué)檢測項(xiàng)目被廣泛應(yīng)用，對(duì)ABO血型的檢測方法己從最初的血清學(xué)反應(yīng)發(fā)展到了 DNA檢測的階段。目前，絕大多數(shù)法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室都能夠通過對(duì)DNA進(jìn)行分析得到較為可靠的ABO血型分型結(jié)果，這為無血痕案件的偵破提供了重要線索。在前期的文獻(xiàn)檢索中發(fā)現(xiàn)：Doi Y.等利用位于ABO基因上的6個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)建了一種基于SNPs位點(diǎn)的血型檢測方法，并從靈敏度以及物種特異性等方面對(duì)該方法進(jìn)行了全面的評(píng)估[38]。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在本章中，完成了對(duì)10份指紋上皮脫落細(xì)胞的WGA擴(kuò)增，并進(jìn)行ABO血型的SNaPshot檢測，以口腔拭子作為陽性對(duì)照，所有10份樣品均得到檢出，其結(jié)果與血清學(xué)檢測一致，說明參考文獻(xiàn)的方法適用于痕量指紋上皮脫落細(xì)胞DNA檢材。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)了一些需要注意的操作步驟，具體討論如下：1)痕量DNA模板的提取與WGA擴(kuò)增污染是偶然意外的物質(zhì)進(jìn)入了法醫(yī)學(xué)樣本，從而影響DNA證據(jù)的識(shí)別與認(rèn)定。這些污染物可能是生物性的或是非生物性的，外源性污染既對(duì)法醫(yī)學(xué)樣本產(chǎn)生影響，也對(duì)最終的鑒定結(jié)果產(chǎn)生影響。從法醫(yī)物證學(xué)的角度看，若污染是來自于人的生物物質(zhì)，比如上皮脫落細(xì)胞，這種類型的污染會(huì)直接影響到最終的DNA證據(jù)，嚴(yán)重影響到該法醫(yī)學(xué)證據(jù)的證明價(jià)值，甚至?xí)䦟?dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的社會(huì)影響及公眾對(duì)司法的信心。

第二章在痕量DNA中SNaPshot檢測ABO血型方法的構(gòu)建與優(yōu)化..... 25

2.1材料和方法........ 27

第三章在痕量DNA中SNaPshot檢測ABO血型方法的應(yīng)用評(píng)估...... 47

3.1材料與方法...... 47

3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果.......... 48

3.3實(shí)驗(yàn)討論..... 62

第四章總結(jié)與展望...... 64

第三章在痕量DNA中SNaPshot檢測ABO血型方法的應(yīng)用評(píng)估

3.1材料與方法
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit (Sigma, U.S.)，ABIPRISMSNaPshotMaitiplexKit (AppliedBiosystems, U.S.)，EasyTaqDNApolymerase(北京 TansGen 公司），Alkaline Phosphatase(Shrimp) (Takara (大連）公司），ExonucleaseI (Takara (大連）公司），通用型DNA純化回收試劑盒（天根生物技術(shù)公司，北京），GeneScan?-120 LIZ Size Standard (Applied Biosystems，U.S.)，Hi-DiFormamide ( Applied Biosystems, U.S.)，BigDye Terminator v3.1(Applied Biosystems，U.S.)，POP4 液體膠（Applied Biosystems，U.S.), NaCl(Sigma,U.S.) MgCkCSigma,U.S.)，Tris(Sigma, U.S.)，Tween-20(Sigma, U.S.),NP40 (Sigma, U.S.), ChelexlOO (Bio-Red, U.S.)；主要儀器.

3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在收集到的48份樣品中，血清學(xué)檢測的結(jié)果是A型16份，B型11份，0型18份，AB型3份。對(duì)48份樣品使用SNaPshot技術(shù)進(jìn)行ABO血型基因型分型，全部48份指紋上皮脫落細(xì)胞均得到檢出，47份口腔拭子得到檢出（第32號(hào)樣品的口腔拭子由于操作失誤在處理過程中損失）。檢出的47份結(jié)果能夠完全匹配。其具體數(shù)據(jù)為：在血清學(xué)判定為A型的16份樣品中AA型3份，AOA型4份，A0°型9份；在血清學(xué)判定為B型的11份樣品中BB型1份,BQA型9份，，BQG型1份；在血清學(xué)判定為?型的18份樣品中QAQA型7份，QGQG型2份，OAQG型9份；在血清學(xué)判定為AB型的3份樣品中AB型3份。
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第四章總結(jié)與展望

隨著身份認(rèn)證及表型相關(guān)的SNPs技術(shù)體系的構(gòu)建，法醫(yī)物證學(xué)中一個(gè)“DNA智能化”的新時(shí)代正在拉幵序幕。隨著從現(xiàn)場采集到的法醫(yī)學(xué)檢材中使用SNPs預(yù)測可見特征（Externally Visible Characteristics, EVC )的能力日益增強(qiáng)，通過EVC預(yù)測對(duì)嫌疑人的相貌進(jìn)行“DNA畫像”為警方尋找嫌疑人提供有力幫助，特別是遇到常規(guī)DNA擴(kuò)增技術(shù)無法使用的情況，在面對(duì)一些“冰凍案件”時(shí)可以有效的縮小拉網(wǎng)排查的范圍。隨著司法實(shí)踐的不斷深入、檢測技術(shù)手段的不斷改進(jìn)和法醫(yī)物證學(xué)數(shù)據(jù)的不斷積累，特別是全球范圍內(nèi)諸多法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室不斷加強(qiáng)技術(shù)合作，積累到不同地區(qū)的法醫(yī)學(xué)SNPs分型數(shù)據(jù)，在不久的將來基于SNPs的法醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建將會(huì)從提議變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，為法醫(yī)物證學(xué)提供新的工具。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：17981