【摘要】：目的:本課題旨在使GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細胞移植電針療法應用于脊髓損傷模型,通過對脊髓損傷大鼠行為學評價、損傷組織中β-catenin、GFAP含量的影響,評價該療法對脊髓損傷的治療作用,為GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細胞移植電針療法在臨床中進一步應用提供理論依據(jù)。方法:實驗選用48只成年SD大鼠在相同條件下適應性喂養(yǎng)1周,隨機分為4組:正常組(A組)12只,不給予特殊處理。將剩余的36只SD大鼠分成:損傷組(B組),GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細胞組(C組),電針加GDNF、HIF-1α基因修飾的神經(jīng)干細胞組(D組)。采用脊髓損傷打擊裝置制作SD大鼠損傷模型,致B組、C組、D組的T_(12)脊髓受損。造模成功后,損傷組(B組)給予局部注射10u1 0.9%NaCl注射液;GDNF、HIF-1α修飾的神經(jīng)干細胞組(C組)給予局部注射10ul雙基因修飾的神經(jīng)干細胞液;GDNF、HIF-1α修飾的神經(jīng)干細胞加電針組(D組)給予局部注射10u1神經(jīng)干細胞液,采用雙側心俞、肺俞行電針治療;分別于移植后4個時間窗(3d、1W、2W、3W)對大鼠進行BBB后肢評分,灌注固定后取損傷段脊髓行HE染色、免疫組化染色、Western Blot等方法,通過檢測移植處神經(jīng)干細胞β-catenin、GFAP含量水平的變化,觀察GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細胞移植電針療法對脊髓損傷的治療效果。結果:1.神經(jīng)干細胞鑒定:細胞懸浮生長,形狀較圓,彼此黏附,并且傳代的細胞是球形分布的。病毒轉染后,24h細胞呈對稱分裂;48h細胞生長旺盛,出現(xiàn)多個細胞形成的個別細胞球;72h細胞分裂多,生長旺盛,形成更多細胞團。2.BBB評分:1周時C組、D組的治療效果相似,2周后D組治療效果優(yōu)于C組。3.HE染色:脊髓損傷初期細胞排列稀疏,結構紊亂,細胞內(nèi)點狀出血,形成明顯空洞。治療后,神經(jīng)細胞內(nèi)局部出血減少,組織空洞相對變小,細胞排列緊密,破壞減輕,神經(jīng)纖維漸恢復。4.免疫組化染色:GFAP陽性表達為黃棕色或棕褐色,位于胞質中且形狀不規(guī)則。GFAP在脊髓損傷后,隨著治療進展,C組在2周后GFAP表達開始下降,D組在3天后GFAP表達即開始下降,3周后,D組GFAP表達低于C組,說明電針治療可抑制GFAP表達。5.Western Blot檢測:脊髓損傷后β-catenin的表達先上升后下降,3天內(nèi)逐漸增加,1W后逐漸降低(P0.05),且D組的β-catenin明顯高于A、B、C組,說明電針治療能促進β-catenin表達。結論:GDNF、HIF-1α基因修飾神經(jīng)干細胞移植配合電針可通過促進β-catenin表達、抑制GFAP表達而治療脊髓損傷。
【圖文】：

⑨混勻增強液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液，加于 PVDF 膜上，待熒光帶明顯后，用濾紙去除多余底物液，蓋上保鮮膜，X 光片。3 統(tǒng)計學實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS22.0 統(tǒng)計軟件分析，治療前后各組之間采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，為差異有統(tǒng)計學意義：P＞0.05 為差異無統(tǒng)計學意義。4 結果4.1 神經(jīng)干細胞的鑒定結果從 SD 新生大鼠大腦內(nèi)分離提取出神經(jīng)干細胞，記錄細胞形態(tài)，神經(jīng)干細胞呈現(xiàn)懸浮生長，Nestin 免疫熒光染色可以看到藍色熒光和紅色熒光，即細胞 Nestin 表達呈陽性，證明所提取的細胞為新生大鼠的神經(jīng)干細胞（圖 1-1）；病毒轉染后，，進行熒光顯微鏡拍照，鏡下顯示綠色熒光證明成功轉染 GDNF 基因，鏡下顯示紅色熒光證明成功轉染 HIF-1α基因。轉染 24h 顯示，細胞呈對稱分裂，形成兩個大小形態(tài)基本相等的細胞（圖 1-2）；轉染 48h 熒光顯微拍照顯示，細胞生長旺盛，出現(xiàn)多個細胞形成的個別細胞球（圖 1-3）；轉染 72h 熒光顯微拍照顯示，細胞分裂多，生長旺盛，細胞球團形成較多（圖 1-4）。

圖 1-2 轉染 24h 含 GDNF(Green)、HIF-1α(Cherry)熒光標記的神經(jīng)干細胞（200×圖 1-3 轉染 48h 含 GDNF(Green)、HIF-1α(Cherry)熒光標記的神經(jīng)干細胞（200×圖 1-4 轉染 72h 含 GDNF(Green)、HIF-1α(Cherry)熒光標記的神經(jīng)干細胞（200×4.2 BBB 評分結果
【學位授予單位】：陜西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R245.97

【參考文獻】

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本文編號：2690268