【摘要】：炎性痛是病理性疼痛的一種,指在傷害性刺激清除后還持續(xù)存在疼痛的病理現象,是臨床上疼痛病癥中最常見的類型之一。由于本身炎性痛病程的反復遷延,治療難度比較大,從而嚴重影響人們的生活質量,因此其外周和中樞機制一直是近幾年研究的焦點。目前,臨床上治療炎性痛主要利用藥物對外周敏化產生抑制作用:首先是非甾類抗炎藥:炎癥反應發(fā)生時,環(huán)氧化酶活性的抑制作用增強,前列環(huán)素的生成減少,從而達到緩解炎性減輕疼痛的目的,但會引起胃腸不適以及腎功能不全等副作用;其次是阿片類制劑,本身是由廣泛分布于外周組織中的免疫細胞所生成的。在炎癥狀態(tài)下初級神經元上的部分阿片受體數量會增加,系統(tǒng)或者局部給予一定的阿片化合物能夠減輕炎性痛,但是其本身對神經系統(tǒng)的獎賞效應或強化作用易產生成癮性;最后是大麻素類,在炎癥模型中,局部給予大麻酯受體激動劑能活化大麻素受體1被動激活腺苷酸環(huán)化酶從而阻斷初級傳入纖維的興奮性來達到鎮(zhèn)痛的目的,但會引起神經毒作用。近年來針對中樞敏化治療的藥物如去甲腎上腺素再攝取抑制劑、五羥色胺和抗癲癇藥等在炎性痛的應用上都暴露了它們療效的不充分性,因此尋求更加安全、有效、簡潔、方便的治療手段勢在必行。臨床實踐和實驗研究都證明了針灸對于炎性痛能夠起到良好的鎮(zhèn)痛作用,但是其確切機制尚不清楚。普遍認為研究針刺治療炎性痛的重要渠道是炎性痛與受體、離子通道和神經遞質之間關系。同時,最新的研究證實傷害性感受神經元內游離的鈣離子和電壓門控鈣離子通道開合狀態(tài)在外周和中樞敏化過程中發(fā)揮了重要作用,而鈣結合蛋白通過其特殊的化學結構-EF手型能夠特異性結合游離的鈣離子,影響胞質內鈣離子濃度,從而使細胞內部信號傳導產生變化,最終達到緩解疼痛的目的。為了研究電針在上述過程中發(fā)揮的作用,本研究采用完全弗氏佐劑(Complete Freund's adjuvant,CFA)模型大鼠作為研究對象,綜合運用行為學、形態(tài)學、分子生物學以及生理學等方法深入研究電針對炎性痛模型大鼠脊神經節(jié)和脊髓背角中鈣結合蛋白(Calcium binding protein,CaBP)的影響,分析電針通過調節(jié)鈣結合蛋白的表達來改變神經元內部鈣離子濃度以及胞內信號轉導途徑,進而調節(jié)神經遞質如CGRP、Glu等的釋放和神經元的興奮性以及突觸后模N-methyl-D-aspartic acid(NMDA)受體激活數量,最終改善脊髓背角中樞敏化狀態(tài),為揭示電針鎮(zhèn)痛機制提供有效的理論依據。目的探討電針刺激足三里穴對炎性痛大鼠脊神經節(jié)和脊髓背角鈣結合蛋白陽性神經元的影響,進一步揭示針刺通過調節(jié)鈣結合蛋白的表達變化而產生鎮(zhèn)痛作用的分子生物學機制,更好的服務于臨床應用。方法取清潔級雄性SD大鼠64只,隨機分為空白組(Control)、對照組(Nacl)、模型組(CFA)及電針組(CFAEA)4組,每組16只。其中對Nacl組左側足底注射50ul的0.9%Nacl溶液,CFA組和CFAEA組在相同部位注射等量的完全弗氏佐劑造模,48h后,對四組大鼠利用異氟烷氣霧設備進行麻醉,同等條件下對CFAEA組進行30min電針干預一次,刺激強度為1mA、2mA和3mA各1Omin,頻率為20/1OOHz,交替波,干預時間在早上11點至12點之間進行,針刺部位為CFA造模區(qū)同側肢體的足三里穴區(qū)。運用行為學檢測方法機械刺激和熱刺激分別于造模前、造模后和電針后三個階段測定各組大鼠足底的痛閾變化。即刻利用4%甲醛灌流或直接斷頭取材分別采用熒光免疫組織化學法及蛋白印跡法檢測大鼠脊神經節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)和脊髓背角中相關鈣結合蛋白的表達變化,并利用統(tǒng)計學原理對相關數據進行分析。結果1.各組大鼠在電針干預后的行為學變化熱痛閾:Contral組與Nacl組,在實驗進行的三個階段無論是同組內部還是組間比較基本一致;CFA組和CFAEA組在造模前與CFA組和Nacl組相比沒有明顯變化,在造模后其數值下降(P0.05);在電針后CFAEA組相比于CFA組數值上升(P0.05)。機械痛閾:CFA組與Nacl組,在實驗進行的三個階段無論是同組內部還是組間比較雖有差異但無統(tǒng)計學意義。電針前,CFA組和CFAEA組與CFA組和Nacl組相比痛閾數值下降(P0.05);電針后,CFAEA組相比于CFA組數值上升(P0.05)。2.電針前后PV、CB以及NECAB1\2陽性神經元在相關脊神經節(jié)的表達變化PV、CB以及NECAB1\2陽性神經元在Control組、Nacl組、CFA組和CF AEA組中的表達趨勢變化不大,Control組和Nacl組相比沒有明顯的區(qū)別,CF A組與Control組和Nacl組相比表達下調(P0.05),CFAEA組與CFA組相比表達上調(P0.05);同時,對降鈣素基因相關肽(Calcitonin gene related pepti de,CGRP)陽性細胞數進行定量統(tǒng)計發(fā)現,CFA組相比于Control組和Nacl組有輕度的上調,CFAEA組與CFA組相比表達下調。其中四組中降CGRP陽性細胞數目同組比較呈現較好的一致性(Control組30.1 ± 3.4個,Nacl組28.3 ±9.4 個,CFA 組 45.0 ± 6.7 個,CFAEA 組 33.5 ± 8.7 個)。對PV、CB以及NECAB1\2陽性神經元進行計數發(fā)現,在DRG神經元中約有70～80%都是與疼痛相關相關的中、小型神經元,而且在各組中都有不同程度與經典疼痛遞質 CGRP 的共表達(PV:1.1 ± 3.76%,CB:1.2 ± 10.5%,NECAB1:28±6.17%,NECAB2:16.2±3.94%)。3.電針前后PV、CB以及NECAB1\2陽性表達物在相關脊髓節(jié)段背角的變化在Control組、Nacl組、CFA組和CFAEA組四組的脊髓背角中PV、CB、NECAB1以及NECAB2陽性物質的表達趨勢基本一致,并且在與疼痛相關的脊髓背角淺層都有大量的分布,四種蛋白基本不與肽能CGRP陽性纖維共表達。通過對背角同等倍率放大的等大視野內鈣結合蛋白陽性神經元胞體周圍的跨神經節(jié)投射過來的CGRP陽性纖維進行統(tǒng)計發(fā)現四種蛋白在Control組、Nacl組、CFA組和CFAEA組中的趨勢基本呈現一致性(Control組49.5 ± 5.8個,Nacl組 50.4 ± 4.4 個,CFA 組 75.9 ±7.7 個,CFAEA 組 48.7 ±6.7 個),Control 組和Nacl組相比變化不明顯,CFA組與Control組和Nacl組相比表達上調(P0.05),CFAEA組與CFA組相比表達下調(P0.05)。WB結果顯示,PV、CB和NECAB1\2在脊髓背角的蛋白含量在Control組、Nacl組、CFA組和CFAEA組變化趨勢呈現相對的一致性,Control組和Nacl組相比無明顯變化;在造模后,CFA組和CFAEA組相比于Control組和Nacl組蛋白含量下降(P0.05);CFAEA組在電針干預后蛋白含量上升(P0.05)。結論:本研究通過行為學、組織化學以及分子生物學的方法探討了針刺對于炎性痛的鎮(zhèn)痛機制。鈣結合蛋白和肽類神經纖維共同參與了針刺鎮(zhèn)痛過程,在這個過程中電針能夠有效地增加病理狀態(tài)下脊神經節(jié)和脊髓背角中PV、CB和NECAB1\2陽性神經元的數量,同時使伴隨的肽類陽性神經纖維表達量下調。電針可能通過四種鈣結合蛋白緩沖細胞內部游離鈣離子來實現對炎性痛的鎮(zhèn)痛作用,同時鈣結合蛋白與肽類神經纖維之間在針刺鎮(zhèn)痛過程中相互關聯(lián)的內在機制還有待進一步的探討。
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【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R245

【參考文獻】

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本文編號：2491630