本文關鍵詞： “補腎活血舒筋方” BMSCs 遷移 NF-κB CXCR4　出處：《南京中醫(yī)藥大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：頸腰痛是骨傷科臨床最常見的疾病,據(jù)統(tǒng)計80%的人一生中會為此就診。椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration, IVDD)是頸腰痛發(fā)病重要的病理因素,但退變的機理目前還不十分明確,有關椎間盤退變的機理及減緩椎間盤退變的方法是當今研究的熱點。研究目的由于椎間盤缺乏血管且細胞數(shù)量少,其本身幾乎不能自我修復。有研究發(fā)現(xiàn),應用骨髓間充質干細胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)治療,可以促進椎間盤組織的再生。由于BMSCs的來源有限及植入問題,促進內源性BSMDs歸巢成為一種新的選擇。臨床研究發(fā)現(xiàn),應用“補腎活血舒筋方”治療頸腰痛療效顯著,既往實驗證明,“補腎活血舒筋方”可以通過調節(jié)核因子(Nuclear factor-κB,NF-κB)抑制炎癥反應和椎間盤退變的發(fā)展。因此,我們提出假說,“補腎活血舒筋方”通過調節(jié)NF-κB/CXCR4促進BMSCs歸巢至退變的椎間盤,進而修復退變的椎間盤,達到治療頸腰痛的目的。本研究通過體外實驗觀察“補腎活血舒筋方”對大鼠BMSCs增殖、遷移及NF-κB、CXCR4表達的影響,并初步探討B(tài)MSCs遷移的可能機制。研究方法取4周齡SPF級SD大鼠,分離其后肢股骨,采用全骨髓貼壁法分離并提取大鼠BMSCs,放置于含有預熱的培養(yǎng)基及10%胎牛血清的T25培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng),應用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。取培養(yǎng)純化至第3代后的BMSCs分別用成脂和成骨培養(yǎng)基定向誘導分化,并用油紅O及茜素紅染色鑒定分化后的細胞。制備“補腎活血舒筋方”中藥原液,取20只成年SD大鼠隨機分成四組,高、中、低中藥血清組分別灌服高、中、低濃度中藥原液,對照組灌服等體積雙蒸水,制備高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清,采用中藥化學指紋圖譜對中藥原液及含藥血清進行質量控制。將高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長良好的第3代BMSCs干預培養(yǎng)24h,應用Cell CountingKit-8(CCK-8)法檢測各組BMSCs的增殖情況。將高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長良好的第3代BMSCs干預培養(yǎng)48h,應用transwell小室觀察不同濃度含藥血清作用后BMSCs的遷移情況。將高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長良好的第3代BMSCs干預培養(yǎng)48h,應用Western Bloting檢測NF-κB、CXCR4蛋白的表達。結果1.大鼠BMSCs的形態(tài)學觀察及鑒定：全骨髓貼壁方法所獲得的BMSCs培養(yǎng)5-7日即可傳代,傳代后增殖速度較原代明顯增快,3d左右可融合達80%。第3至第5代細胞純化程度高,細胞增殖能力強;傳代后培養(yǎng)的BMSCs呈紡錘形或多角形,細胞數(shù)目多、排列緊密時可呈漩渦狀排列。成脂誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)BMSCs,每三天可觀察到改變,誘導結束后觀察到細胞內被油紅O染紅的脂滴；成骨誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)BMSCs,每三天可觀察到改變,誘導14天后培養(yǎng)基內可見能夠被茜素紅染色的鈣結節(jié)。2、“補腎活血舒筋方”含藥血清的制備：液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)儀在中藥原液中檢測到12種有效成分,其中7種入血,血清樣品中以阿魏酸(川芎、當歸)、川續(xù)斷皂苷(續(xù)斷)、原兒茶酸(狗脊)含量最高,含藥血清中者三種有效成分含量具有濃度梯度差。3、“補腎活血舒筋方”對BMSCs增殖及遷移的影響：CCK-8結果顯示,各濃度含藥血清組細胞生存率與對照組有明顯區(qū)別,P0.05,但是各濃度含藥血清組之間差異不顯著,P0.05。將高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與BMSCs干預培養(yǎng)48h后,倒置相差顯微鏡下觀察各組上室下側均可見細胞,說明BMSCs存在遷移行為。其中,與對照組比較,低濃度含藥血清組遷移數(shù)目增多,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。中、高濃度含藥血清組遷移細胞數(shù)目明顯多于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),其中高濃度含藥血清組遷移細胞數(shù)最多。高、中、低濃度含藥血清組之間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4、“補腎活血舒筋方”對NF-κB、CXCR4蛋白表達的影響：Western bloting結果顯示,各實驗組κB、CXCR4蛋白均有表達,與對照組比較,高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血組κB、CXCR4蛋白表達量增高明顯(P0.05),差異有統(tǒng)計學意義。高、中、低濃度含藥血清組之間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論“補腎活血舒筋方”可促進大鼠BMSCs NF-κB、CXCR4蛋白的表達。說明“補腎活血舒筋方”可能通過提高NF-κB、CXCR4的表達促進BMSCs的遷移。
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【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R274.9

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本文編號：1474046