發(fā)布時(shí)間：2018-01-18 09:28

  本文關(guān)鍵詞：益氣活血解毒方調(diào)控Tregs相關(guān)SNPs位點(diǎn)治療氣虛血瘀型晚期卵巢癌的研究　出處：《中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：由于卵巢癌的早期癥狀不明顯且缺乏特異性,其早期診斷的技術(shù)也一直未見提高,患者發(fā)現(xiàn)時(shí)一般已處于晚期階段,雖然對(duì)其治療方法一直在探索,其標(biāo)準(zhǔn)治療手術(shù)加化療的方案也一直在精進(jìn),但其效果差強(qiáng)人意,尚未取得令人滿意的療效,而且該病發(fā)病后容易復(fù)發(fā),故卵巢癌一直是女性健康的一大殺手。臨床數(shù)據(jù)顯示約70%的卵巢癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期,但是目前,行最大程度的滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類與紫杉醇類藥物的一線化療方案仍為其標(biāo)準(zhǔn)治療。近幾十年來(lái),隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步、發(fā)展以及化療藥物的發(fā)現(xiàn)和使用,手術(shù)和化療已經(jīng)有了很大的進(jìn)步,但據(jù)美國(guó)流行病學(xué)和數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,近三十年來(lái)晚期卵巢癌的5年生存率仍未見明顯的改善、提高。近年來(lái),中醫(yī)藥對(duì)于卵巢癌患者的治療得到了人們的關(guān)注,無(wú)論是在延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期、提高患者的生活質(zhì)量、改善放化療產(chǎn)生的副反應(yīng)方面都得到了大家的認(rèn)可。經(jīng)過(guò)前期臨床研究我們發(fā)現(xiàn):晚期卵巢癌患者的中醫(yī)臨床證型以氣虛證和血瘀證等證為主要證型。故我的導(dǎo)師盧雯平教授針對(duì)該類型的患者運(yùn)用自擬益氣活血解毒方進(jìn)行臨床辨證治療,該方是在近現(xiàn)代名中醫(yī)張錫純用以治療婦科腫瘤名方“理沖湯”的基礎(chǔ)之上,結(jié)合我科名老中醫(yī)孫桂芝教授、樸炳奎教授的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行加減而成的有效的抗腫瘤驗(yàn)方,主要的藥物組成是:黃芪、山藥、白術(shù)、枸杞子、女貞子、莪術(shù)、三棱、青皮、海藻、青蒿、白花蛇舌草、穿山甲、全蟲,黃芪補(bǔ)氣力量最強(qiáng),效果最好,為方中益氣主要藥物,山藥、白術(shù)健脾氣,升清氣,培補(bǔ)后天之氣,故而能夠從根本上調(diào)節(jié)人體氣的生成,同時(shí)達(dá)到治病必求于本的目的。氣為血之帥,血為氣之母,補(bǔ)氣的同時(shí)也要注重補(bǔ)人體之精血,使得氣血相和,不致偏頗,故加入枸杞子、女貞子等補(bǔ)血養(yǎng)精之品。莪術(shù)、三棱、青皮、海藻、穿山甲、全蟲等物具有活血行氣、軟堅(jiān)散結(jié)之功能,益氣的同時(shí)注重活血行氣。青蒿、白花蛇舌草則以清熱解毒為主要功用。綜上所述,理沖湯消補(bǔ)兼施,扶正祛瘀,加入蟲類藥取其久病入絡(luò),增加活血通絡(luò)散結(jié)之力,加一些清化之品白花蛇舌草、青蒿取其本病日久易化熱化火傷津之意。Tregs細(xì)胞是現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)對(duì)卵巢癌研究的新視角,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的病理機(jī)制多與免疫系統(tǒng)相關(guān),而Tregs細(xì)胞就是免疫系統(tǒng)中與免疫相關(guān)的重要一環(huán)。免疫治療被認(rèn)為是突破現(xiàn)有治療的最有希望療法,但腫瘤微環(huán)境中復(fù)雜的免疫抑制分子機(jī)制及缺乏對(duì)卵巢癌個(gè)體免疫差異的認(rèn)識(shí),使得其在臨床未取得明顯進(jìn)展。最新研究表明,調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)是卵巢癌腫瘤微環(huán)境復(fù)雜免疫網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控免疫逃逸和血管生成的關(guān)鍵免疫抑制因子,其相關(guān)基因的多態(tài)性(SNPs)與卵巢癌預(yù)后密切相關(guān),研究Tregs細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制與卵巢癌的關(guān)系對(duì)臨床制定卵巢癌的治療方案具有積極作用。CD24參與細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)移,被證實(shí)是血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附受體,導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞在血液中的轉(zhuǎn)移,被認(rèn)為是一種新的致癌因子,也是腫瘤診斷和預(yù)后的重要標(biāo)志,且有相關(guān)研究表明CD24與Tregs發(fā)揮免疫功能具有相關(guān)性。通過(guò)臨床的前期研究我們發(fā)現(xiàn)益氣活血解毒方可以調(diào)節(jié)外周血中Tregs的水平,增強(qiáng)晚期卵巢癌患者機(jī)體的免疫力,從而降低其免疫抑制的作用,緩解患者的臨床癥狀,同時(shí)有效提高其生活質(zhì)量。初步實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)益氣活血解毒中藥聯(lián)合DC疫苗對(duì)小鼠移植瘤生長(zhǎng)有抑制作用,其療效的發(fā)揮與免疫抑制因子TGFβ1和IL-10有關(guān),而這兩種細(xì)胞因子來(lái)源于Tregs。故而我們推測(cè)該方延長(zhǎng)氣虛血瘀型晚期卵巢癌生存可能與調(diào)控Tregs相關(guān)的免疫有關(guān)。擬從Tregs切入,采用SNPs及mRNA芯片技術(shù),用以探究與辨證論治療效有關(guān)的Tregs相關(guān)基因的多態(tài)(SNPs)特點(diǎn)及該方對(duì)對(duì)應(yīng)標(biāo)志基因表達(dá)的影響,方證與療效相結(jié)合,從而探索晚期卵巢癌氣虛血瘀證型的基因多態(tài)性的特點(diǎn)以及其中藥干預(yù)機(jī)制,為中藥個(gè)體化治療提供實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。目的:1篩選出與益氣活血解毒方療效相關(guān)的SNPs位點(diǎn);2探究益氣活血解毒方對(duì)差異SNPs對(duì)應(yīng)的基因mRNA表達(dá)的影響。方法:本研究共入組300例晚期卵巢癌患者,證候辨證為氣虛血瘀型。服益氣活血解毒方半年后抽取外周血10～15ml,運(yùn)用Illumina Human Exome-12v1-1芯片,從300例氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的血液中提取DNA(TIANGEN TIANamp Blood DNA Kit),對(duì)樣品的gDNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)后進(jìn)行全基因組的擴(kuò)增、雜交,雜交后,通過(guò)清洗去掉非特異性結(jié)合的DNA,剩下特異性結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行單堿基延伸,染色后利用Illuminai Scan Reader進(jìn)行掃描,將iScan系統(tǒng)掃描得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Illumina官方軟件GenomeStudio Genotyping模塊中,利用該模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用 GeneChip(?)PrimeView TM Human Gene Expression Array芯片,從氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的血液中提取mRNA。觀察患者的無(wú)進(jìn)展生存期(PFS),并對(duì)其進(jìn)行癌抗原125(CA125)數(shù)值的記錄及生活質(zhì)量的療后評(píng)估,根據(jù)患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期將患者分為2組,一組為中藥有效組,其PFS中位無(wú)進(jìn)展生存,另一組為中藥無(wú)效組,其PFS≤中位無(wú)進(jìn)展生存。通過(guò)有效組和無(wú)效組SNPs比較,篩出顯著差異的SNPs位點(diǎn),即可能對(duì)中藥敏感的SNPs位點(diǎn),GO分析:將顯著差異的SNPs位點(diǎn)定位得到基因利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)做功能富集,得到顯著的GO功能類別,Pathway分析:得到的基因利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)做功能富集,得到差異基因顯著富集的生物通路;有效組和無(wú)效組mRNA表達(dá)的比較,篩選出差異表達(dá)的基因,同上,進(jìn)行GO分析和Pathway分析,得到差異顯著的GO功能類別跟生物通路;將SNPs位點(diǎn)定位所得的基因與差異表達(dá)基因取交集,發(fā)現(xiàn)中藥干預(yù)的標(biāo)志基因。結(jié)果:1篩選出具有顯著性差異的SNPs位點(diǎn)1773個(gè),位于外顯子上的SNPs位點(diǎn)共有1033個(gè),非同義突變的SNPs位點(diǎn)有970個(gè);對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的GO號(hào)有:GO:0006955、GO:0045087,其中GO:0006955與機(jī)體的免疫應(yīng)答有關(guān),GO:0045087與先天性的免疫反應(yīng)有關(guān),富集到GO:0006955上的基因有18個(gè),具體為:FYB,RGS1,SUSD2,FCGRT,IL18RAP,CR2,IFI44L,CD96,C8A,CD 1C,CXCR5,IL16,SEMA4D,PDCD1LG2,HLA-DMA,MICA,PKHD1L1,HLA-DPA1;富集到GO:0045087 上的基因有 24個(gè),具體是 TAB2,FCN1,MAP3K1,GAB1,DTX4,VNN1,CR2,FOXO3,WIPF3,ITPR2,F12,TRAF3,CD 180,EGF,NLRC5,C8A,NLRP4,IFI16,TLR3,FRS2,CD14,CD19,BPIFB3,DEFB132。對(duì)變異位點(diǎn)基因KEGG富集分析得到有顯著差異的通路14條,主要涉及嗅覺傳導(dǎo),酪氨酸代謝,糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨生物合成,脂肪酸的降解,精氨酸和脯氨酸代謝,β-丙氨酸代謝,莨菪烷類、哌啶、吡啶生物堿生物合成,丙酮酸代謝,長(zhǎng)期的壓抑,黃酮和黃酮醇的生物合成,苯丙氨酸代謝,PPAR信號(hào)通路,堿基切除修復(fù),味覺傳導(dǎo)等信號(hào)通路。2通過(guò)對(duì)mRNA差異表達(dá)分析,得到顯著差異基因158個(gè),其中上調(diào)基因58個(gè),下調(diào)基因100個(gè),通過(guò)上調(diào)的差異基因的GO分析發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)功能領(lǐng)域與免疫相關(guān)的GO號(hào)6個(gè),GO:0002227、GO:0006955、GO:0002842、GO:0002768、GO:0050776、GO:0050777,GO:0002227,它們與粘膜上的先天免疫應(yīng)答、免疫應(yīng)答、正向調(diào)控T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能有關(guān);通過(guò)下調(diào)的差異基因的GO分析發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)功能領(lǐng)域與免疫相關(guān)的GO號(hào)有10個(gè),GO:0002566,GO:0002684,GO:0002741,GO:0002925,GO:0002309,GO:0002827,GO:0002218,GO:0045087,GO:0045824,GO:0002286,它們與體細(xì)胞突變導(dǎo)致的免疫受體多元化、免疫系統(tǒng)的正向調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)中細(xì)胞因子的分泌調(diào)節(jié)、循環(huán)免疫球蛋白介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)、免疫應(yīng)答、輔助T細(xì)胞Ⅰ型的免疫反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)的激活、先天免疫應(yīng)答、先天免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)中T細(xì)胞的激活有關(guān)。mRNA差異基因上調(diào)Passway富集得到8條相關(guān)的通路,主要涉及哮喘,瘧疾,造血細(xì)胞系,TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,吞噬體,異體移植排斥,腫瘤的轉(zhuǎn)錄失調(diào);下調(diào)的相關(guān)通路3條,主要涉及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體,溶酶體,吞噬小體。3根據(jù)基因和表達(dá)譜的GO分析在免疫相關(guān)功能上取交集可知:與益氣活血解毒方療效相關(guān)的可能的免疫方面的生物功能是免疫系統(tǒng)的應(yīng)答,具體的GO號(hào)是GO:0006955,基因分型富集到該term上的基因有18個(gè),具體為:FYB,RGS1,SUSD2,FCGRT,IL18RAP,CR2,IFI44L,CD96,C8A,CDIC,CXCR5,IL16,SEMA4D,PDCD1LG2,HLA-DMA,MICA,PKHD1L1,HLA-DPA1,表達(dá)譜富集到該 term 上的基因有 CEACAM8,DEFA1,DEFA1,THBS1,CD24。4可能的中藥干預(yù)療效差異的標(biāo)志基因:CD40、AFF3、EIF2AK3、WNK1、FYB、FBXL13、PLXNC1、BCL11A、IFI16、GNG7。5益氣活血解毒方能夠改善氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的免疫功能,產(chǎn)生差異療效。6益氣活血解毒方可以通過(guò)對(duì)基因以及相關(guān)通路的調(diào)節(jié)調(diào)控Tregs細(xì)胞,但與SNPs未見明顯相關(guān)性,可能與DNA去甲基化或miRNA有關(guān)。結(jié)論:1與益氣活血解毒方療效相關(guān)的SNPs位點(diǎn)有1773個(gè),這些位點(diǎn)可能是對(duì)中藥敏感的SNPs位點(diǎn)。2益氣活血解毒方療效的差異標(biāo)志基因可能為:CD40、AFF3、EIF2AK3、WNK1、FYB、FBXL13、PLXNC1、BCL11A、IFI16、GNG7。3益氣活血解毒方可能通過(guò)改善氣虛血瘀型晚期卵巢癌患者的免疫功能,產(chǎn)生差異療效。4益氣活血解毒方可能通過(guò)對(duì)基因以及相關(guān)通路的調(diào)節(jié)調(diào)控Tregs細(xì)胞治療氣虛血瘀型晚期卵巢癌,但與SNPs位點(diǎn)未見明顯相關(guān)性,可能與DNA去甲基化或miRNA有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R273

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1440358