本文關(guān)鍵詞：扶正活血解毒方藥對腫瘤干細胞依賴于PMNs促腫瘤轉(zhuǎn)移的作用研究　出處：《中國中醫(yī)科學院》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景:我科著眼于中醫(yī)藥抗腫瘤的研究已有相當長的時間,作為國家中醫(yī)腫瘤�？漆t(yī)療中心,從70年代就率先開展了以扶正培本為治則的實驗和臨床研究,相繼研究出健脾益腎顆粒、益肺清化膏等獲國家新藥證書,重點改善腫瘤患者臨床癥狀,提高腫瘤患者生存質(zhì)量。雖然應用健脾補腎等扶正方法來治療惡性腫瘤患者,有助提高其生存質(zhì)量,延長生存期。但針對惡性腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移方面仍需要進一步挖掘中醫(yī)中藥的作用和價值。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤區(qū)別良性腫瘤的主要特征之一,也是導致患者癌癥相關(guān)惡化死亡的首要原因。從90年代開始我科工作重點放到防治腫瘤術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移的研究方面,本研究基于中醫(yī)的“瘀毒”學說,在之前扶正、清熱解毒處方基礎(chǔ)之上加入活血化瘀解毒中藥,臨床應用扶正活血解毒方藥治療晚期乳腺癌患者取得了較好療效。扶正培本與化瘀解毒兼顧已成為抑制腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的一個重要治則和研究方向,前期有關(guān)的實驗研究也不斷證實活血解毒中藥、方劑對腫瘤轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。近幾年隨著對腫瘤干細胞研究以及腫瘤微環(huán)境的認識越來越深入,干細胞參與腫瘤微環(huán)境與腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)有一定的聯(lián)系。此外,腫瘤相關(guān)的炎癥與腫瘤的進展密切相關(guān),尤其是腫瘤浸潤的中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞,前期較多的研究中顯示中性粒細胞具有一定抑制癌細胞的作用,目前越來越多證據(jù)表明其在復雜腫瘤微環(huán)境中具有促腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的作用,其中多重復雜的分子機制和分子之間具體相關(guān)性仍有待進一步的研究論證。本研究就是在前期扶正解毒、干細胞實驗研究等基礎(chǔ)上,進一步建立乳腺癌細胞、乳腺癌干細胞以及與中性粒細胞共培養(yǎng)細胞模型分析探討扶正活血解毒方藥抑制腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機制。方法:培養(yǎng)乳腺癌細胞并進行干細胞的富集分離,采用MTT法檢測扶正活血解毒方藥藤黃酸中藥單體、姜黃素中藥單體、貝母素甲中藥單體、隱丹參酮中藥單體對4T1細胞增殖抑制的情況。建立細胞模型,分別建立乳腺癌(4T1)組、4T1與中性粒細胞共培養(yǎng)(PMNs)組、乳腺癌干細胞(CSLCs)組,CSLCs與PMNS共培養(yǎng)組,對照組為細胞組,實驗組為加藥組。觀察4T1組、CSLCs組、4T1與PMNs共培養(yǎng)組、CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組,對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的影響以及相關(guān)分子機制;分別建立對照組和藥物干預組(藤黃酸組、姜黃素組、貝母素甲組、隱丹參酮組),對照組為細胞模型組,實驗組均為加入中藥干預。觀察活血解毒中藥單體對乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的影響以及基于干細胞和中性粒細胞分子機制。檢測:培養(yǎng)乳腺癌4T1細胞、乳腺癌干細胞、血液提取中性粒細胞并進行共培養(yǎng),Transwell小室檢測4T1細胞、4T1干細胞以及與中性粒細胞共培養(yǎng),各組腫瘤細胞過膜轉(zhuǎn)移細胞數(shù)以及扶正活血解毒方藥作用乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移細胞數(shù);ELISA方法檢測各細胞組、四種藥物藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮干預作用腫瘤細胞后上清中相關(guān)細胞因子u-PA、VEGF分泌水平;Western blot方法檢測各細胞組、扶正活血解毒方藥干預作用細胞后的PAI-1、TFPI-2的蛋白表達情況。結(jié)果:1扶正活血解毒藥物對乳腺癌細胞的增殖抑制作用研究中藥單體成分藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮對乳腺癌4T1細胞的增殖抑制作用,研究結(jié)果顯示在不同的藥物濃度作用24h后,4T1細胞的生長受到不同程度抑制,結(jié)果呈濃度依賴性如圖(1.1-1.4)。根據(jù)MTT的結(jié)果結(jié)合本實驗具體情況,貝母素選擇60μmol/L作為進一步實驗的藥物作用濃度;姜黃素選擇15μmol/L作為進一步實驗的藥物作用濃度;藤黃酸選擇0.5μmol/L作為進一步實驗的藥物作用濃度;隱丹參酮選擇30μmol/L作為進一步實驗的藥物作用濃度。2藥物對4T1細胞、4T1干細胞及與PMNs共培養(yǎng)對細胞轉(zhuǎn)移能力的作用藥物按選擇濃度對乳腺癌細胞各處理組進行干預,姜黃素選擇15μmol/L作為藥物作用濃度;藤黃酸選擇0.5μmol/L作為藥物作用濃度;貝母素甲選擇60μmol/L作為藥物作用濃度;隱丹參酮選擇30μmol/L作為藥物作用濃度。對4T1組、CSLCs組、4T1與PMNs共培養(yǎng)組、CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組分別進行transwell細胞遷移實驗。將四組細胞組分別加入四種藥物進行干預作用24h后,結(jié)果顯示,在藥物作用方面:藥物干預組細胞穿過的數(shù)目較對照組轉(zhuǎn)移細胞數(shù)量減少(P0.05)。對照組總轉(zhuǎn)移數(shù)最多,為514.80,各組平均128.70。姜黃素干預組細胞總轉(zhuǎn)移數(shù)最少,為369.40,各組平均92.35。各組轉(zhuǎn)移細胞總數(shù)之間比較:空白組貝母素甲干預組藤黃酸干預組隱丹參酮干預組姜黃素干預組,扶正活血解毒方藥藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮均有不同程度抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的作用。在細胞模型方面:乳腺癌4T1組轉(zhuǎn)移平均數(shù)117.20;CSLCs組轉(zhuǎn)移平均數(shù)為133.40;4T1與PMNs共培養(yǎng)組轉(zhuǎn)移平均數(shù)為126.00;CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組轉(zhuǎn)移平均數(shù)為138.20。各組之間比較:4T1組總轉(zhuǎn)移數(shù)最少,CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組轉(zhuǎn)移數(shù)最多。各細胞模型組間比較:CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組CSLCs組4T1與PMNs共培養(yǎng)組4T1組,CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增多,P0.05,結(jié)果有統(tǒng)計學差異。CSLCs組較4T1組增多,P0.05,結(jié)果有統(tǒng)計學差異。4T1與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增多,P0.05,結(jié)果有統(tǒng)計學差異。4T1與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組減少,P0.05,差異無統(tǒng)計學意義。3藥物對4T1細胞、干細胞及共培養(yǎng)條件下腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子活性的影響實驗結(jié)果顯示:細胞上清中uPA分子:4T1與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增高(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。4T1與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組略有增高,但(P0.05),結(jié)果無統(tǒng)計學差異。CSLCs組較4T1組增高(P0.05),CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組增高(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增高(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。藥物干預處理組藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮較對照組均降低(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。細胞上清中VEGF分子;4T1與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增高(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。CSLCs組較4T1組增高(P0.05),CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組增高(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增高(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。藥物干預處理組藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮較對照組降低(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。4活血解毒方藥對4T1細胞、干細胞及共培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的影響實驗結(jié)果顯示:測定提取細胞蛋白中PAI-1的表達:4T1與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組表達增高(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。4T1與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組略有增高,但(P0.05),結(jié)果無統(tǒng)計學意義。CSLCs組較4T1組增高(P0.05),CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組增高(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組增高(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。藥物干預處理組藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮較對照組蛋白表達降低(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。測定蛋白中TFPI-2的含量表達:4T1與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組降低(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。CSLCs組較4T1組降低(P0.05),CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較CSLCs組降低(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。CSLCs與PMNs共培養(yǎng)組較4T1組降低(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。藥物干預處理組藤黃酸、姜黃素、貝母素甲、隱丹參酮均較對照組增高(P0.05),結(jié)果有統(tǒng)計學差異。結(jié)論:干細胞是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的先決條件,相比普通乳腺癌細胞具有更強的遷移能力。研究認為干細胞與存在于腫瘤微環(huán)境中的中性粒細胞相互作用促使腫瘤細胞發(fā)生滾動粘附繼而外滲到達遠處組織,形成復發(fā)轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果表明基于中醫(yī)“瘀毒”學說扶正活血解毒方藥對腫瘤細胞有一定的抑制增殖作用,抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用,其作用機制可能與活血解毒方藥調(diào)節(jié)血液粘度,降低細胞因子uPA、VEGF的表達,作用于干細胞,影響中性粒細胞分化,改善腫瘤微環(huán)境,降低細胞轉(zhuǎn)移率相關(guān)。從蛋白表達結(jié)果分析其作用機制可能與扶正活血解毒方藥在腫瘤微環(huán)境中下調(diào)中性粒細胞相關(guān)因子IL-8的分泌,促使N2型向N1型轉(zhuǎn)化,降低中性粒細胞的浸潤,改善腫瘤微環(huán)境,改善血液流動狀態(tài),降低PAI-1蛋白表達,提高TFPI-2蛋白表達發(fā)揮促腫瘤凋亡,抑制血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。
[Abstract]:In recent years , it has been proved that the traditional Chinese medicine for treating advanced breast cancer has a certain inhibitory effect on tumor metastasis . The effects of traditional Chinese medicine on the proliferation of breast cancer cells were studied . The results showed that the growth of 4T1 cells , 4T1 stem cells , and PMNs co - cultured the cells of breast cancer cells . There was no statistical difference between CSLCs and PMNs . The results showed that there was no statistical difference between the groups of CSLCs and PMNs ( P0.05 ) . There was significant difference between CSLCs and PMNs ( P0.05 ) . The results showed that there were significant differences in the expression of TFPI - 2 in CSLCs group compared with those in group 4T1 ( P0.05 ) .

【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R273

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本文編號：1357152