本文關鍵詞：天麻酚性成分對H_2O_2誘導PC12細胞氧化損傷的保護作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《云南中醫(yī)學院》 2013年

天麻酚性成分對H_2O_2誘導PC12細胞氧化損傷的保護作用研究

文金隆  

【摘要】：目的：課題組前期研究證明天麻具有較強的抗腦缺血再灌注損傷作用，并提示其作用機制與抗氧化損傷有關，其活性為一組脂溶性酚性成分。本研究以H_2O_2誘導損傷PC12細胞為細胞氧化應激損傷模型，對天麻3個提取物和15份單體成分進行活性篩選，探討天麻酚性成分對細胞氧化應激損傷的保護作用，并初步探討其可能的作用機制。 方法： 1、采用RPMI-1640培養(yǎng)基、含10%FBS和0.4%雙抗的常規(guī)培養(yǎng)條件對PC12細胞進行培養(yǎng)、傳代和凍存，并以MTT法、細胞計數(shù)法和臺盼藍染色計數(shù)法繪制其生長曲線，初步掌握PC12細胞的體外生長增殖特性。 2、采用細胞形態(tài)學觀察和MTT法測定細胞存活率作為評價指標，探討研究用H_2O_2誘導PC12細胞氧化損傷模型的適宜濃度。 3、采用細胞形態(tài)學觀察和MTT法測定細胞存活率作為評價指標，探討研究用依達拉奉對H_2O_2誘導的PC12細胞氧化損傷模型的有效濃度。 4、采用細胞形態(tài)學觀察和MTT法測定細胞存活率作為評價指標，評價天麻3個提取物和15份單體成分對H_2O_2誘導的PC12細胞氧化損傷模型的保護作用。 5、采用DCFH-DA熒光探針法、LDH酶標法、硫代巴比妥酸酶標法和T-SOD羥胺法，評價天麻活性成分對H_2O_2誘導的PC12細胞內(nèi)ROS水平、細胞外LDH活性、LDH泄漏率、細胞內(nèi)MDA含量和SOD活性的影響。 結(jié)果： 1、從MTT法繪制的生長曲線得出，在本實驗室96孔板常規(guī)培養(yǎng)的條件下，PC12細胞數(shù)量以100個/mL接種培養(yǎng)6d未達到平臺期，100000個/mL細胞接種3d即達到平臺期，適宜的細胞接種濃度為6000、8000和10000個/mL細胞，確定選擇8000個/mL細胞的接種濃度在25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，繪制培養(yǎng)瓶培養(yǎng)PC12細胞生長曲線。從細胞計數(shù)法和臺盼藍染色計數(shù)法繪制的生長曲線得出，以8000個/mL的細胞濃度接種在25cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)到第4d長至約90%的覆蓋率，第5d時長滿，隨著細胞數(shù)量的不斷增多、生長空間減少，細胞發(fā)生接觸抑制和密度抑制。 2、40μmol·L~(-1)-80μmol·L~(-1)的H_2O_2可使PC12細胞數(shù)量逐漸減少，多數(shù)細胞突起收回，胞體變圓，部分變圓細胞成團存在，胞體邊緣模糊，折光性減弱，貼壁能力降低；與正常組比較，40μmol·L~(-1)-80μmol·L~(-1)的H_2O_2誘導PC12細胞存活率在18.6%-66.0%的損傷（P0.01），氧化損傷PC12細胞的H_2O_2適宜濃度范圍在40μmol·L~(-1)-80μmol·L~(-1)。 3、依達拉奉在0.918mmol·L~(-1)（160μg·mL~(-1)）給藥濃度下對50μmol·L~(-1)H_2O_2誘導PC12細胞損傷的形態(tài)改善最為明顯。細胞存活率檢測結(jié)果：與正常組比較，50μmol·L~(-1)H_2O_2損傷PC12細胞2h后的模型組細胞存活率為26.9%（P0.01）；與模型組比較，依達拉奉在給藥濃度達到0.918mmol/L時提高細胞存活率10.9個百分點（P0.01）。 4、天麻3個提取物及15份單體中，天麻EtOAc（20μg·mL~(-1)）和8#（80μg·mL~(-1)）對50μmol·L~(-1)H_2O_2誘導PC12細胞損傷的形態(tài)改善最為明顯。細胞存活率檢測結(jié)果：與模型組比較，天麻EtOAc（20μg·mL~(-1)）和8#（80μg·mL~(-1)）分別提高細胞存活率14.7和9.9個百分點（P0.01），1#和6#也提高細胞存活率（P0.05或P0.01），其同濃度結(jié)果重復性差。 5、天麻EtOAc和8#對H_2O_2誘導的PC12細胞內(nèi)ROS水平、細胞外LDH活性、LDH泄漏率、細胞內(nèi)MDA含量和SOD活性測試結(jié)果表明，與模型組比較，天麻EtOAc（80μg·mL~(-1)）和8#（40、80μg·mL~(-1)）受試物組對細胞產(chǎn)生的熒光強度降低差異明顯（P0.01）；天麻EtOAc （20、40、80μg·mL~(-1)）受試物組胞外的LDH活性明顯低于模型組（P0.05或P0.01），LDH泄漏率降低差異明顯（P0.05或P0.01），8#（40、80μg·mL~(-1)）受試物組胞外LDH活性明顯高于模型組（P0.05或P0.01），提高LDH泄漏率的差異明顯（P0.01）；天麻EtOAc（20、40、80μg·mL~(-1)）受試物組降低細胞內(nèi)MDA含量的趨勢明顯，其中40μg·mL~(-1)組降低細胞內(nèi)MDA含量的差異明顯（P0.05）；天麻EtOAc（20、40μg·mL~(-1)）和8#（20、40μg·mL~(-1)）受試物組提高細胞內(nèi)的T-SOD活性差異明顯（P0.01），天麻EtOAc和8#的80μg·mL~(-1)給藥組降低細胞內(nèi)T-SOD活性差異明顯（P0.01）。 結(jié)論： 1、在25cm2培養(yǎng)瓶中以8000個/mL（1600個/cm2）細胞懸液接種PC12細胞培養(yǎng)到第4d時的細胞最適宜細胞傳代、接種和凍存，其群體倍增時間介于12h至24h之間。 2、采用40μmol·L~(-1)-80μmol·L~(-1)的H_2O_2損傷PC12細胞2h可復制PC12細胞氧化應激損傷模型。 3、依達拉奉對H_2O_2損傷PC12細胞2h造成氧化應激損傷模型的較佳保護濃度為0.918mmol·L~(-1)（160μg·mL~(-1)）。 4、天麻酚性成分8#、1#、6#和天麻EtOAc提取物具有改善氧化損傷PC12細胞的形態(tài)，提高模型細胞存活率的作用。 5、天麻EtOAc提取物具有保護H_2O_2損傷后細胞膜的完整性、降低損傷后細胞內(nèi)ROS的水平、提高細胞內(nèi)SOD活性和抑制脂質(zhì)過氧化的作用；天麻酚性成分8#具有降低H_2O_2損傷后細胞內(nèi)ROS的水平和提高細胞內(nèi)SOD活性的作用，在所設劑量下不是通過保護細胞膜的完整性和降低脂質(zhì)過氧化作用發(fā)揮其抗氧化損傷的作用。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：云南中醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R285
【目錄】：

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本文編號：125607