本文關鍵詞：PLD4在腫瘤相關巨噬細胞抑制結腸癌增殖中的作用研究

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【摘要】：目的PLD4是一種新蛋白,屬于PLD家族中的一員。PLD4由于缺乏PX和PH域,所以并沒有PLD酶活性。動物實驗研究表明雖然PLD4在體內廣泛表達,但在免疫密切相關的組織中,肝臟、脾臟、腦組織、淋巴結的PLD4表達水平相對較高。研究發(fā)現(xiàn)小鼠大腦皮質的原始小膠質細胞存在PLD4表達,LPS刺激后小膠質細胞中PLD4表達顯著提高,并發(fā)現(xiàn)PLD4可促進小膠質細胞活化。腫瘤相關巨噬細胞在識別和殺傷結腸癌過程中具有重要作用。雖然小膠質細胞和腫瘤相關巨噬細胞具有免疫學共性,但PLD4在腫瘤相關巨噬細胞中的表達及具體功能尚未有相關研究。故本研究擬探討PLD4在結腸癌腫瘤相關巨噬細胞中的表達及功能。方法(1)結腸癌組織中檢測PLD4表達采用免疫組織化學方法檢測110例結腸癌患者組織標本中PLD4表達情況。并在同一組織連續(xù)石蠟切片中,采用CD68標記結腸癌組織中腫瘤相關巨噬細胞,并研究PLD4陽性表達與CD68陽性巨噬細胞間聯(lián)系。采用Western blot檢測12例結腸癌患者癌組織及癌旁組織中PLD4蛋白表達水平。(2)THP-1腫瘤相關巨噬細胞模型的建立采用THP-1細胞作為巨噬細胞模型,首先THP-1細胞加入PMA誘導成為巨噬細胞,隨后加入LPS聯(lián)合IFN-γ誘導成為M1型腫瘤相關巨噬細胞,加入IL-4誘導成為M2型腫瘤相關巨噬細胞。采用分子表面標志CD86及CD16鑒定M1型腫瘤相關巨噬細胞;采用ELISA檢測在巨噬細胞,M1型巨噬細胞及M2型巨噬細胞中促炎癥因子IL-1,IL-8,IL-6及TNF-α表達水平。(3)THP-1巨噬細胞中存在PLD4表達采用Western blot檢測THP-1巨噬細胞模型中PLD4蛋白表達水平。采用RT-PCR檢測THP-1巨噬細胞模型中PLD4分子表達水平。(4)PLD4在M1型腫瘤相關巨噬細胞中的功能研究采用si RNA干擾PLD4在巨噬細胞中的表達,Western blot檢測si RNA干擾后M1型巨噬細胞模型中PLD4蛋白抑制水平。QRT-PCR檢測si RNA干擾后M1型巨噬細胞模型中PLD4分子抑制水平。采用ELISA檢測在si RNA干擾后M1型巨噬細胞促炎癥因子IL-1,IL-6及TNF-α表達水平,以研究巨噬細胞活化功能。(5)PLD4干擾后的M1型巨噬細胞條件培養(yǎng)基對結腸癌細胞影響分別收集PLD4干擾組與對照組條件培養(yǎng)基與HT-29、HCT116、SW620結腸癌細胞共培養(yǎng),采用CCK8細胞增殖試劑盒,細胞凋亡試劑盒及細胞周期試劑盒檢測條件培養(yǎng)基對三種結腸癌細胞株的細胞增殖、細胞凋亡與細胞周期的影響。結果(1)PLD4在結腸癌腫瘤相關巨噬細胞表達免疫組化發(fā)現(xiàn)PLD4呈環(huán)狀表達于結腸癌組織的間質細胞及淋巴結細胞胞質中。在同一組織連續(xù)切片中發(fā)現(xiàn)部分CD68標記的腫瘤相關巨噬細胞存在PLD4陽性表達。分析110例結腸癌石蠟組織切片發(fā)現(xiàn)PLD4的陽性表達與結腸癌臨床分期相關(P0.01),與性別、年齡、病理分期及轉移不相關。在12例結腸癌手術標本中,Western blot結果提示雖然結腸癌及癌旁組織中均存在PLD4表達,但PLD4在腫瘤組織中表達水平高于癌旁。(2)PLD4存在于M1型腫瘤相關巨噬細胞THP-1細胞作為細胞模型誘導成為巨噬細胞、M1巨噬細胞、M2巨噬細胞。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)M1巨噬細胞高表達MHC-Ⅱ類分子CD16及CD86。同時EILISA結果表明M1巨噬細胞相對于M2及巨噬細胞表達更高水平IL-1,IL-8,IL-6及TNF-α等促炎因子。Western blot蛋白水平及RT-PCR分子水平分別發(fā)現(xiàn)PLD4表達于M1腫瘤相關巨噬細胞;(3)PLD4參與M1型腫瘤相關巨噬細胞的活化si RNA干擾巨噬細胞中PLD4表達后,Western blot及QRT-PCR結果發(fā)現(xiàn)si RNA干擾后M1型巨噬細胞模型中PLD4表達明顯受到抑制。同時檢測si RNA干擾后檢測M1型巨噬細胞促炎癥因子IL-1,IL-6及TNF-α表達,結果發(fā)現(xiàn)以上促炎因子水平明顯降低。(4)PLD4介導M1型巨噬細胞發(fā)揮抑制結腸癌細胞增殖作用采用干擾PLD4表達組及對照組M1型巨噬細胞條件培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HT-29、HCT116、SW620細胞,結果發(fā)現(xiàn)當PLD4被抑制時M1型巨噬細胞無法正常活化,導致M1巨噬細胞對結腸癌細胞殺傷作用減弱。結論(1)本研究證實結腸癌組織腫瘤相關巨噬細胞存在PLD4表達;(2)PLD4參與體外M1型腫瘤相關巨噬細胞正�；罨�;(3)PLD4通過介導M1型腫瘤相關巨噬細胞活化在體外發(fā)揮抑制結腸癌細胞作用。
【關鍵詞】：PLD4 腫瘤相關巨噬細胞 結腸癌 抗腫瘤
【學位授予單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 第1章 前言14-19
• 1.1 結腸癌與腫瘤相關巨噬細胞14-15
• 1.2 腫瘤相關巨噬細胞15-16
• 1.3 巨噬細胞與小膠質細胞16-17
• 1.4 PLD4 主要功能17-19
• 第2章 材料19-24
• 2.1 相關儀器19
• 2.2 結腸癌組織、實驗所需細胞、試劑及配方19-24
• 2.2.1 結腸癌組織標本19
• 2.2.2 實驗所需細胞株19-20
• 2.2.3 即用型試劑20
• 2.2.4 常用試劑耗材20
• 2.2.5 主要試劑配方20-24
• 第3章 方法24-41
• 3.1 結腸癌組織PLD4 免疫組化染色24-25
• 3.2 結腸癌組織標本PLD4 Western bloting25-27
• 3.3 細胞培養(yǎng)27-29
• 3.4 THP-1 誘導成為腫瘤相關巨噬細胞29
• 3.5 腫瘤相關巨噬細胞的鑒定29-30
• 3.6 腫瘤相關巨噬細胞蛋白提取及PLD4 Western bloting30-31
• 3.7 M1 型腫瘤相關巨噬細胞反轉錄-PCR31-33
• 3.8 ELISA檢測腫瘤相關巨噬細胞細胞因子分泌33-34
• 3.9 M1 型腫瘤相關巨噬細胞PLD4 siRNA干擾34-35
• 3.10 M1 腫瘤相關巨噬細胞實時定量-PCR35-37
• 3.11 條件培養(yǎng)基的制備37-38
• 3.12 條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)結腸癌細胞38
• 3.13 結腸癌細胞增殖檢測38-39
• 3.14 結腸癌細胞凋亡檢測39
• 3.15 結腸癌細胞周期檢測39-40
• 3.16 統(tǒng)計學方法40-41
• 第4章 結果41-56
• 4.1 結腸癌組織中存在PLD4 表達41-45
• 4.2 體外THP-1 誘導成為巨噬細胞45-47
• 4.3 PLD4 主要表達于M1 型腫瘤相關巨噬細胞47-48
• 4.4 PLD4 參與M1 型腫瘤相關巨噬細胞活化48-50
• 4.5 PLD4 介導M1 型腫瘤相關巨噬細胞體外抑制結腸癌增殖50-56
• 第5章 討論56-61
• 全文總結61-62
• 參考文獻62-68
• 文獻綜述68-79
• 參考文獻75-79
• 附錄：中英文名詞縮略79-81
• 攻讀學位期間的研究成果81-82
• 致謝82

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