本文關(guān)鍵詞：組織特異性溶瘤腺病毒對(duì)膀胱腫瘤干細(xì)胞的作用

  更多相關(guān)文章： 膀胱腫瘤干細(xì)胞 組織特異性溶瘤腺病毒 柯薩奇病毒受體 ALDH

【摘要】：目的:每年新發(fā)膀胱腫瘤中,大約70%的是非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌,經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切除術(shù)手術(shù)和膀胱內(nèi)化療藥物灌注是目前最主要的治療方式,但經(jīng)過治療后,5年內(nèi)仍將近一半的膀胱腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)或進(jìn)展成肌層浸潤(rùn)性膀胱癌。學(xué)者們認(rèn)為這可能與膀胱腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。膀胱腫瘤干細(xì)胞是存在于膀胱腫瘤中的少數(shù)具有自我更新和增殖分化潛能的細(xì)胞,膀胱腫瘤的化療藥物抵抗、復(fù)發(fā)和進(jìn)展與膀胱腫瘤干細(xì)胞的存在密切相關(guān)。該次研究應(yīng)用ALDEFLUOR kit分選試劑盒通過流式細(xì)胞儀分選膀胱腫瘤干細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞鑒定;測(cè)定膀胱腫瘤干細(xì)胞表面CAR和CD46的表達(dá)情況;用本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建完成的膀胱組織特異性溶瘤腺病毒感染膀胱腫瘤干細(xì)胞,觀察Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR(APU-E1A-AR)膀胱腫瘤特異性溶瘤腺病毒對(duì)膀胱腫瘤干細(xì)胞的殺傷效果。方法:常規(guī)培養(yǎng)膀胱腫瘤細(xì)胞株T24和EJ。應(yīng)用ALDEFLUOR kit分選試劑盒通過流式細(xì)胞儀分選膀胱腫瘤干細(xì)胞;首先,用無(wú)血清平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察膀胱腫瘤干細(xì)胞的克隆形成能力,用40uM順鉑干預(yù)膀胱腫瘤細(xì)胞,測(cè)定存活細(xì)胞內(nèi)ALDH的表達(dá)情況,繼續(xù)培養(yǎng)分選得到的膀胱腫瘤干細(xì)胞一段時(shí)間后,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ALDH的表達(dá)情況,觀察膀胱腫瘤干細(xì)胞是否有部分發(fā)生分化。綜合膀胱腫瘤干細(xì)胞的克隆形成能力、化療藥物抵抗及分化能力對(duì)分選所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。其次,提取膀胱腫瘤細(xì)胞及膀胱腫瘤干細(xì)胞RNA,用RT-PCR法測(cè)定膀胱腫瘤干細(xì)胞中CAR基因和CD46基因的表達(dá)情況,比較兩種細(xì)胞內(nèi)CAR與CD46的表達(dá)是否有差異;用細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)膀胱腫瘤干細(xì)胞表面CAR和CD46的情況,同時(shí)將其表達(dá)量與未分選膀胱腫瘤細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比;用MTT法檢測(cè)膀胱組織特異性溶瘤腺病毒殺傷膀胱腫瘤干細(xì)胞的最佳病毒滴度和干預(yù)時(shí)間,用分選得到的最佳干預(yù)方案對(duì)膀胱腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),在光學(xué)顯微鏡下觀察膀胱組織特異性溶瘤腺病毒對(duì)膀胱腫瘤干細(xì)胞的干預(yù)效果。結(jié)果:經(jīng)過分選發(fā)現(xiàn),約有15%的膀胱腫瘤細(xì)胞內(nèi)是膀胱腫瘤干細(xì)胞,與未經(jīng)分選的膀胱腫瘤相比,膀胱腫瘤干細(xì)胞的克隆形成能力強(qiáng),可繼續(xù)分化出ALDH(—)細(xì)胞,并具有化療藥物抵抗能力,以上一系列表現(xiàn)均符合腫瘤干細(xì)胞的特性。RT—PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),膀胱腫瘤干細(xì)胞表面CAR基因的表達(dá)較未分選膀胱腫瘤細(xì)胞低,兩種腫瘤細(xì)胞內(nèi)的CD46基因表達(dá)無(wú)明顯差異;細(xì)胞組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),膀胱腫瘤干細(xì)胞內(nèi)CAR的表達(dá)較未分選腫瘤細(xì)胞低,兩者的CD46表達(dá)都比較高。通過MTT法發(fā)現(xiàn),病毒MOI值為80,干預(yù)48h后,超過一半的膀胱腫瘤干細(xì)胞發(fā)生裂解死亡,說明膀胱組織特異性溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR對(duì)膀胱腫瘤干細(xì)胞具有一定殺傷作用。結(jié)論:用ALDH作為分子標(biāo)記物分選得到的ALDH(+)膀胱腫瘤細(xì)胞具有化療藥物抵抗、自我更新及繼續(xù)分化等能力,符合腫瘤干細(xì)胞的特性,因此ALDH可以作為分選膀胱腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)志物。同時(shí),用MOI為80的膀胱組織特異性溶瘤腺病毒對(duì)膀胱腫瘤干細(xì)胞作用48h后出現(xiàn)一定干預(yù)效果。
【關(guān)鍵詞】：膀胱腫瘤干細(xì)胞 組織特異性溶瘤腺病毒 柯薩奇病毒受體 ALDH
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-17
• 1.1 膀胱腫瘤干細(xì)胞研究及治療進(jìn)展9-15
• 1.2 基因治療15
• 1.3 溶瘤腺病毒可靶向治療膀胱腫瘤干細(xì)胞15-16
• 1.4 本實(shí)驗(yàn)研究目的及技術(shù)路線16-17
• 第二章 材料與方法17-23
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑17
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器17-18
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理18
• 2.4 干細(xì)胞分選18-19
• 2.5 腫瘤細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)19-20
• 2.6 大劑量順鉑（CIS）誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)20
• 2.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率20-21
• 2.8 免疫細(xì)胞化學(xué)21-22
• 2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT—PCR）22-23
• 第三章 結(jié)果23-30
• 3.1 膀胱腫瘤干細(xì)胞的分選和鑒定23-24
• 3.2 膀胱腫瘤干細(xì)胞分化鑒定24-25
• 3.3 膀胱腫瘤干細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)25
• 3.4 大劑量順鉑干預(yù)后存活膀胱腫瘤細(xì)胞ALDH的表達(dá)情況25-26
• 3.5 膀胱腫瘤干細(xì)胞CAR和CD46的表達(dá)情況26-27
• 3.6 Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR溶瘤腺病毒干預(yù)膀胱腫瘤干細(xì)胞27-30
• 第四章 討論30-35
• 第五章 結(jié)論35-36
• 第六章 參考文獻(xiàn)36-40
• 第七章 在學(xué)期間的研究成果40-41
• 第八章 致謝41-42
• 第九章 中英文縮寫對(duì)照42

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