本文關鍵詞：血清饑餓對U251細胞氧化磷酸化活性的影響及其分子機制研究

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【摘要】：氧化磷酸化是細胞維持正常生命活動的主要供能方式,早期的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中,腫瘤細胞以糖酵解為主為細胞增殖提供能量,這一效應被稱為“瓦伯格效應”。近年來的研究顯示,不同的腫瘤細胞其能量代謝方式存在一定的差異,同時在不同的培養(yǎng)條件和微環(huán)境中,腫瘤細胞會改變其原有的代謝途徑,以適應細胞的生長。因此開展腫瘤代謝途徑及分子調節(jié)機制的研究對深入了解和認識腫瘤的生長、增殖機制及腫瘤的臨床治療都有重要的意義。 血清是細胞生長必需的成分,細胞在無血清或低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后,細胞將停滯在G0/G1期,細胞生長明顯受抑制。因此血清饑餓培養(yǎng)是體外細胞培養(yǎng)的一個逆環(huán)境,研究逆境條件下即血清饑餓培養(yǎng)條件下,腫瘤細胞的能量代謝途徑、氧化磷酸化活性及代謝相關的基因的表達變化,將有助于對腫瘤代謝調節(jié)機制的研究。本研究以293T細胞和U251細胞為研究材料,通過不同的呼吸抑制劑處理兩種細胞,確定其主要的能量代謝途徑。然后研究以糖酵解為主的腫瘤細胞血清饑餓處理對其能量代謝途徑、氧化磷酸化活性及其代謝調控相關的基因的表達變化。 本研究用不同濃度的氧化磷酸化電子傳遞鏈抑制劑和乳酸脫氫酶抑制劑處理293T細胞和U251細胞后,檢測細胞的生長和ATP水平。通過比對兩種細胞對抑制劑的敏感性確定其能量代謝類型。研究發(fā)現(xiàn)293T細胞對寡霉素處理敏感,寡霉素(Oligo)對293T細胞增殖有顯著的抑制作用,說明293T細胞是以氧化磷酸化為主產生ATP。而糖酵解抑制劑草氨酸(Oa)對U251細胞增殖有顯著的抑制作用,表明U251細胞以糖酵解為主為細胞提供能量。隨后,對以糖酵解為主的U251細胞進行血清饑餓處理不同時間,分析血清饑餓對U251細胞增殖、ATP水平、呼吸代謝途徑及氧化磷酸化活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)血清饑餓處理后,U251細胞生長明顯受抑制,細胞被阻滯在G0/G1期；細胞ATP水平顯著上升,細胞ROS水平降低。對代謝相關的酶活性和表達水平檢測發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶(LDH)蛋白表達及活性下降,丙酮酸脫氫酶(PDH)蛋白表達及活性升高；細胞線粒體數(shù)量增加,線粒體DNA拷貝數(shù)增加,線粒體電子傳遞復合物I活性增強；細胞氧化磷酸化相關蛋白(NDUFB8、NDUFA9、VDAC、ND1)含量升高；以上結果顯示血清饑餓后U251細胞糖酵解途徑受抑制,氧化磷酸化活性增強。同時我們又檢測了細胞代謝調控相關蛋白的表達水平的變化,結果發(fā)現(xiàn)血清饑餓后U251細胞HIF-1α蛋白表達水平顯著降低,C-myc、NRF1、TFAM蛋白含量均有明顯增加；同時檢測到細胞周期調控蛋白p27表達升高、CyclinD1蛋白含量增加、CyclinB1蛋白含量降低。 綜上所述,以糖酵解為主的U251細胞經(jīng)血清饑餓處理后,細胞生長明顯受抑制,細胞被阻滯在G0/G1期,ATP水平增加,ROS水平降低,細胞糖酵解途徑受抑制,氧化磷酸化活性增強。調控其代謝途徑改變的可能的分子機制是血清饑餓處理使HIF-1α下調,抑制糖酵解途徑,同時促進C-myc蛋白水平上調。C-myc通過促進NRF1的表達,促進線粒體轉錄調控因子TFAM上調,進而增強線粒體DAN復制,轉錄及翻譯水平,促進細胞氧化磷酸化活性增強,細胞ATP含量升高。U251細胞在饑餓條件下ATP水平的增加可能是逆境環(huán)境中細胞維持生存的一種應急調節(jié)機制。本研究以U251細胞研究對象,通過血清饑餓處理,研究其能量代謝途徑的改變及其可能的調節(jié)機制,提示腫瘤細胞的能量代謝途徑可隨著其培養(yǎng)條件及微環(huán)境的改變而改變,以適應新的環(huán)境。同時對其分子調節(jié)機制的研究將對深入了解和認識膠質瘤細胞的生長、增殖機制及腦腫瘤的臨床治療具有重要意義。
【關鍵詞】：血清饑餓 U251細胞 Warburg效應 氧化磷酸化
【學位授予單位】：云南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-7
• 縮略詞對照表7-11
• 第1章 引言11-24
• 1 細胞能量代謝11-14
• 1.1 無氧呼吸11-13
• 1.2 有氧呼吸13-14
• 2 線粒體結構與氧化磷酸化14-20
• 2.1 線粒體結構14-15
• 2.2 線粒體功能15
• 2.3 氧化磷酸化活性15-20
• 2.3.1 線粒體數(shù)量15-16
• 2.3.2 線粒體DNA拷貝數(shù)16
• 2.3.3 線粒體蛋白16-17
• 2.3.4 線粒體呼吸鏈的組成17-20
• 3 腫瘤細胞能量代謝20-23
• 3.1 WARBURG效應21-22
• 3.2 CRABTREE效應22-23
• 4 研究的目的和意義23-24
• 第2章 材料與方法24-41
• 2.1 實驗材料24-27
• 2.1.1 細胞株24
• 2.1.2 培養(yǎng)基、血清及胰酶24
• 2.1.3 PCR引物合成24
• 2.1.4 主要試劑及耗材24-26
• 2.1.5 主要儀器26-27
• 2.2 實驗方法27-41
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)27-28
• 2.2.2 呼吸抑制劑處理細胞檢測細胞生長(MTS)及細胞ATP含量變化28-29
• 2.2.2.1 呼吸抑制劑處理28-29
• 2.2.2.2 呼吸抑制劑處理細胞檢測細胞生長(MTS)29
• 2.2.2.3 呼吸抑制劑處理細胞檢測ATP含量29
• 2.2.3 細胞ATP檢測29-30
• 2.2.4 血清饑餓30
• 2.2.5 細胞周期流式檢測30
• 2.2.6 細胞計數(shù)30-31
• 2.2.7 細胞ROS流式檢測31
• 2.2.8 PDH活性檢測31-32
• 2.2.9 LDH活性檢測32-33
• 2.2.10 DNA提取33
• 2.2.11 RT-PCR33-35
• 2.2.12 MIT GREEN流式檢測35
• 2.2.13 免疫熒光35
• 2.2.14 WESTERN BLOT35-39
• 2.2.15 線粒體復合物I活性檢測39-41
• 第3章 實驗結果41-56
• 3.1 293T、U251細胞能量代謝途徑檢測41-45
• 3.2 血清饑餓對U251細胞生長和ATP含量的影響45-48
• 3.2.1 血清饑餓對U251細胞生長的影響45-47
• 3.2.2 血清饑餓對U251細胞ATP及ROS含量的影響47-48
• 3.3 血清饑餓對U251細胞PDH、LDH蛋白表達及活性的影響48-50
• 3.4 血清饑餓對U251細胞氧化磷酸化活性的影響50-55
• 3.4.1 血清饑餓對U251細胞線粒體數(shù)目的影響50-51
• 3.4.2 血清饑餓對U251細胞線粒體MTDNA的影響51-52
• 3.4.3 血清饑餓對U251細胞線粒體呼吸鏈復合物I活性的影響52-53
• 3.4.4 血清饑餓對U251細胞OXPHOS相關蛋白表達的影響53-54
• 3.4.5 血清饑餓對U251細胞OXPHOS活性調控蛋白表達的影響54-55
• 3.5 血清饑餓對U251細胞細胞周期相關蛋白的影響55-56
• 第4章 討論56-58
• 4.1 腫瘤代謝途徑的多樣性56
• 4.2 培養(yǎng)條件和微環(huán)境影響腫瘤代謝途徑56
• 4.3 血清饑餓U251細胞通過降低HIF-1α升高增加細胞ATP含量56-58
• 結論58-60
• 參考文獻60-63
• 附錄1：常見溶液的配制方法63-65
• 附錄2：碩士研究生期間論文發(fā)表和項目參與情況65-66
• 致謝66

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉岷,鄺勝利;缺氧誘導因子活性的調節(jié)[J];河南醫(yī)學研究;2004年01期

2 羅蘭,何云剛,舒坤賢,賴建華,譚德勇,張虹;血清對人腦膠質瘤細胞株U251基因表達的影響[J];云南大學學報(自然科學版);2000年02期

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本文編號：961830