本文關(guān)鍵詞：磷酸果糖激酶相關(guān)微小RNA影響腫瘤細(xì)胞糖代謝的機制研究

  更多相關(guān)文章： 微小RNA128 肝型磷酸果糖激酶 肺癌 糖酵解 代謝

【摘要】：背景及意義癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病之一。在所有癌癥中,肺癌是男性死亡人數(shù)最多、女性死亡人數(shù)高居第二位的惡性腫瘤。與正常細(xì)胞通過線粒體進行氧化磷酸化不同的是,癌細(xì)胞主要通過糖酵解過程獲得生命活動所需要的能量,產(chǎn)生大量乳酸和少量ATP,這種現(xiàn)象被稱作瓦博格效應(yīng)(Warburg effect)。磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK)是糖酵解途徑中最關(guān)鍵的限速酶,它能夠催化6-磷酸果糖反應(yīng)生成1,6-二磷酸果糖。微小RNA (microRNA, miRNA)是一類內(nèi)源性的、在進化上非常保守的、其長度約為22個核苷酸的非編碼小RNA。經(jīng)過一系列加工,成熟的miRNA能夠完全或不完全地與nRNA的3'端非翻譯區(qū)結(jié)合,通過抑制翻譯或使得靶向mRNA降解來調(diào)節(jié)基因表達。越來越多的研究表明,niRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用；除了能夠抑制癌細(xì)胞的增殖、促進癌細(xì)胞的凋亡外,miRNA還能通過調(diào)控糖代謝途徑中的酶,來調(diào)節(jié)糖代謝途徑,但是否存在niRNA通過靶向PFK,從而調(diào)控癌細(xì)胞糖酵解途徑,目前尚不清楚。本研究旨在闡明PFK相關(guān)miRN A調(diào)控肺癌細(xì)胞糖代謝的機制,為分子靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。方法(1)通過查閱、分析文獻,篩選出適合于進一步研究的肝型磷酸果糖激酶(PFK liver type, PFKL) 。(2)運用生物信息學(xué)方法篩選,發(fā)現(xiàn)miR-128與PFKL之間存在潛在的靶點關(guān)系。(3)根據(jù)miRNA合成原則,設(shè)計合成miR-128的mimics、inhibitor及其對應(yīng)的陰性對照。用Lipofectamine 2000裝miR-128的mimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染NCI-H460 及 NCI-H1299細(xì)胞,以分別升高或降低細(xì)胞中miR-128的水平。運用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)分析轉(zhuǎn)染后,miR-128在細(xì)胞中的表達變化,以確認(rèn)轉(zhuǎn)染效果。(4)用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)染相對應(yīng)的RNAs之后,細(xì)胞內(nèi)PFKL在nRNA水平的表達變化；Western blot分析PFKL在蛋白水平的表達變化。(5)通過雙熒光素酶報告分析系統(tǒng),進一步確認(rèn)niR-128與PFKL之間的靶點關(guān)系。(6)運用MTT、結(jié)晶紫染色法分別分析轉(zhuǎn)染RNAs之后,對細(xì)胞生長及克隆形成的影響；熒光光度法分析轉(zhuǎn)染RNAs之后,對細(xì)胞內(nèi)ATP含量變化的影響；分光光度法分析轉(zhuǎn)染RNAs之后,對細(xì)胞葡萄糖攝入量和乳酸生成量的影響。評價miR-128表達水平的變化對肺癌細(xì)胞糖代謝的影響。(7) qRT-PCR分析干擾AKT信號通路對miR-128及PFKL表達的影響。(8)通過Western blot分析異常表達miR-128之后,對總AKT及磷酸化AKT表達量的影響,分析niR-128調(diào)控糖酵解的機制。結(jié)果(1)PFKL在肺癌細(xì)胞NCI-H460中相對高表達；miR-128在NCI-H1299中相對高表達；miR-128的表達與PFKL的表達呈負(fù)相關(guān)。(2)生物信息學(xué)篩選發(fā)現(xiàn),PFKL是miR-128的潛在靶點,雙熒光素酶報告分析進一步驗證了它們之間存在的靶點關(guān)系。同時,miR-128表達水平上調(diào)能抑制PFKL在mRNA水平及蛋白水平的表達；反之,抑制miR-128的表達,則能促進PFKL在mRNA水平及蛋白水平的表達。共轉(zhuǎn)染miR-128與PFKL的過表達載體,能夠補救由miR-128引起的PFKL的表達下降。(3)上調(diào)miR-128的表達能夠抑制肺癌細(xì)胞的生長以及克隆的形成；而抑制miR-128的表達,則能促進肺癌細(xì)胞的生長以及克隆的形成；干擾PFKL的表達能夠抑制肺癌細(xì)胞的生長以及克隆的形成,過表達PFKL能夠促進肺癌細(xì)胞的生長以及克隆的形成。(4)在臨床患病樣本中,PFKL的表達顯著高于正常樣本；而miR-128在臨床患病樣本中的表達則顯著低于正常樣本；在臨床患病樣本中,miR-128的表達與PFKL的表達呈負(fù)相關(guān)。(5)上調(diào)miR-128的表達能夠使得肺癌細(xì)胞內(nèi)ATP含量增加、葡萄糖攝入量減少以及乳酸生成量減少；而抑制miR-128的表達,則使得肺癌細(xì)胞內(nèi)ATP含量減少、葡萄糖攝入量增加以及乳酸生成量增加；干擾PFKL的表達能夠使得肺癌細(xì)胞內(nèi)ATP含量增加、葡萄糖攝入量減少以及乳酸生成量減少,過表達PFKL能夠減少肺癌細(xì)胞內(nèi)ATP含量,增加葡萄糖攝入量以及乳酸生成量。(6)干擾AKT信號通路能夠促進miR-128的表達；相反,干擾AKT信號通路則顯著抑制PFKL在mRNA水平的表達。(7)過表達miR-128能夠顯著降低磷酸化AKT的表達；相反,抑制miR-128的表達對磷酸化AKT的表達無明顯影響；異常表達的miR-128對總AKT水平無明顯影響。結(jié)論本研究闡明了miR-128與PFKL之間的靶點調(diào)控機制,進一步驗證了miRNAs對糖酵解途徑中關(guān)鍵限速酶的調(diào)控作用。同時,研究表明,miR-128通過調(diào)控糖酵解途徑中的最為關(guān)鍵的限速酶PFKL (PFK liver type),從而對肺癌細(xì)胞內(nèi)ATP含量、肺癌細(xì)胞葡萄糖攝入量以及乳酸生成量產(chǎn)生影響。我們的研究結(jié)果還表明,miR-128對糖酵解過程的調(diào)節(jié),可能是通過AKT信號通路來完成的。這些結(jié)果說明,miRNA在肺癌細(xì)胞的糖酵解途徑中起著重要的作用；同時,miR-128可能作為肺癌治療的新靶點。
【關(guān)鍵詞】：微小RNA128 肝型磷酸果糖激酶 肺癌 糖酵解 代謝
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 引言13-15
• 1 實驗方案設(shè)計15-20
• 1.1 實驗的目的及意義15
• 1.2 研究內(nèi)容15-16
• 1.2.1 miR-128的靶點確認(rèn)分析15
• 1.2.2 miR-128及PFKL在肺癌細(xì)胞中的初始表達分析15
• 1.2.3 miR-128對PFKL的表達調(diào)控分析15
• 1.2.4 異常表達miR-128或PFKL對細(xì)胞生長以及克隆形成的影響15-16
• 1.2.5 臨床樣本分析16
• 1.2.6 PFKL表達量與患者總體生存率的相關(guān)性分析16
• 1.2.7 異常表達miR-128或PFKL對細(xì)胞葡萄糖攝入及乳酸生成的影響16
• 1.2.8 異常表達miR-128或PFKL對細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響16
• 1.2.9 miR-128作用于PFKL的機制分析16
• 1.3 技術(shù)路線圖16-17
• 1.4 實驗方案17-20
• 1.4.1 肺正常上皮細(xì)胞及肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)17-18
• 1.4.2 細(xì)胞總RNA提取及qRT-PCR18
• 1.4.3 雙熒光素酶報告分析18
• 1.4.4 miR-128對PFKL的蛋白調(diào)控分析18
• 1.4.5 MTT分析18
• 1.4.6 結(jié)晶紫染色法18
• 1.4.7 臨床血液樣本中PFKL及miR-128表達分析18
• 1.4.8 KM-plot分析18
• 1.4.9 葡萄糖攝入量及乳酸生成量的測定18
• 1.4.10 ATP含量的測定18-19
• 1.4.11 miR-128調(diào)控PFKL的作用機制分析19
• 1.4.12 數(shù)據(jù)總結(jié)分析19-20
• 2 實驗材料與方法20-42
• 2.1 實驗材料20-30
• 2.1.1 主要實驗儀器20-21
• 2.1.2 主要試劑耗材21-24
• 2.1.3 實驗細(xì)胞株、菌株及載體24
• 2.1.4 肺癌患者及健康志愿者血液樣本收集24
• 2.1.5 主要試劑及配制24-30
• 2.2 實驗方法30-42
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代30
• 2.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇30-31
• 2.2.3 細(xì)胞凍存31
• 2.2.4 細(xì)胞計數(shù)31
• 2.2.5 合成RNAs31
• 2.2.6 轉(zhuǎn)染RNAs31-32
• 2.2.7 總RNA提取32
• 2.2.8 RNA純度分析32
• 2.2.9 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)32-33
• 2.2.10 質(zhì)粒的構(gòu)建33-35
• 2.2.11 無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取35
• 2.2.12 雙熒光素酶報告分析相關(guān)操作35-36
• 2.2.13 普通PCR和qRT-PCR36-38
• 2.2.14 Western blot檢測蛋白表達38-39
• 2.2.15 MTT分析細(xì)胞生長情況39-40
• 2.2.16 細(xì)胞克隆形成實驗40
• 2.2.17 臨床血液樣本中PFKL及miR-128表達測定40
• 2.2.18 KM-plot分析相關(guān)操作40
• 2.2.19 細(xì)胞葡萄糖攝入量的測定40
• 2.2.20 細(xì)胞內(nèi)乳酸含量的測定40
• 2.2.21 細(xì)胞內(nèi)ATP含量測定40
• 2.2.22 miR-128調(diào)控PFKL的機制分析40
• 2.2.23 統(tǒng)計方法40-42
• 3 實驗結(jié)果42-59
• 3.1 篩選出PFKL相關(guān)的miRNA42
• 3.2 成功構(gòu)建PFKL 3’UTR野生型及突變型載體42-43
• 3.3 PFKL是miR-128的直接靶點43-45
• 3.4 PFKL在NCI-H460中相對高表達,miR-128在NCI-H1299中相對高表達45
• 3.5 成功構(gòu)建PFKL過表達載體45-46
• 3.6 miR-128抑制PFKL在mRNA及蛋白水平的表達46-49
• 3.7 過表達PFKL能夠補救由miR-128引起的PFKL mRNA水平降低49-50
• 3.8 過表達PFKL能夠補救由miR-128引起的PFKL蛋白水平的降低50-51
• 3.9 miR-128能夠抑制肺癌細(xì)胞的生長及克隆的形成51-52
• 3.10 miR-128的表達與PFKL的表達呈負(fù)相關(guān)52-54
• 3.11 miR-128介導(dǎo)代謝方式的轉(zhuǎn)變54-56
• 3.12 miR-128通過AKT信號通路來調(diào)控PFKL56-57
• 3.13 異常表達miR-128對AKT在mRNA水平的表達無明顯影響57-59
• 4 結(jié)論59-61
• 5 討論61-63
• 參考文獻63-66
• 附錄A 縮寫表66-68
• 附錄B 綜述68-80
• 參考文獻75-80
• 在學(xué)研究成果80-82
• 致謝82

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 沈慶,蔣幼凡,薛亞梅,吳澤志;肺癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附力學(xué)的研究[J];中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志;2003年02期

2 王天立,黃建安,於葛華,毛一香,王光杰,張學(xué)光;可溶性CD40配體對肺癌細(xì)胞A549的生物學(xué)作用及其機制研究[J];癌癥;2004年11期

3 佟倜,劉偉,張羽,孫迎春;高壓芒刺靜電場對體外培養(yǎng)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的生物效應(yīng)[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年02期

4 趙俊剛;陳侃;石文君;;藥物極性對肺癌細(xì)胞線粒體功能的影響[J];中華腫瘤防治雜志;2007年12期

5 ;國際新聞[J];科技導(dǎo)報;2008年02期

6 邸志強;侯繼申;薛承巖;杜新生;楊亞平;;外周血端粒酶活性測定對循環(huán)肺癌細(xì)胞的診斷價值[J];疑難病雜志;2008年11期

7 王光輝;黃桂君;葉小群;余時滄;錢桂生;;肺癌細(xì)胞和正常人氣道上皮細(xì)胞線粒體膜電位的比較[J];西北國防醫(yī)學(xué)雜志;2009年05期

8 孟龍;張陽德;;小鼠Lewis肺癌細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞體外共培養(yǎng)的生物學(xué)行為[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年36期

9 ;潰瘍藥可抑制肺癌細(xì)胞生長[J];臨床合理用藥雜志;2011年18期

10 李維娜;楊繼慶;劉淵聲;文峻;翟明明;屈學(xué)民;;鋅酞氰介導(dǎo)的光動力學(xué)療法對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的影響研究[J];中國醫(yī)學(xué)裝備;2012年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王洪武;黃友章;;凍融的肺癌細(xì)胞對骨髓樹突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[A];第一屆中國腫瘤靶向治療技術(shù)大會論文集[C];2003年

2 李智勇;劉增禮;吳錦昌;周俊東;申詠梅;勞勤華;;~(125)I-脫氧尿嘧啶核苷對肺癌細(xì)胞A549的殺傷作用[A];首屆全國分子核醫(yī)學(xué)暨分子影像學(xué)學(xué)術(shù)交流會資料匯編[C];2006年

3 李智勇;劉增禮;吳錦昌;周俊東;申詠梅;勞勤華;;~(125)I-脫氧尿嘧啶核苷對肺癌細(xì)胞A549的殺傷作用[A];第三屆全國核素顯像暨核素治療學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2006年

4 王秦秦;姜平;李繼梅;唐睿珠;陳新明;;肺癌細(xì)胞相關(guān)蛋白分子實驗研究[A];西部大開發(fā) 科教先行與可持續(xù)發(fā)展——中國科協(xié)2000年學(xué)術(shù)年會文集[C];2000年

5 謝慶軍;李季風(fēng);胡曉燕;;超級智能基因藥物對人惡性肺癌細(xì)胞的的抑制作用[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2006年

6 李鳴;黃承鈺;魏大鵬;;藥食兩用植物提取物影響肺癌細(xì)胞生長的血清藥理學(xué)研究[A];中國營養(yǎng)學(xué)會第九次全國營養(yǎng)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

7 馮華松;黃友章;段蘊鈾;楊平地;李泳群;蘭雨;;氬氦刀冷凍處理的肺癌細(xì)胞增強樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)[A];第一屆中國腫瘤微創(chuàng)治療研討會暨中國抗癌協(xié)會腫瘤微創(chuàng)治療專業(yè)委員會成立大會論文集[C];2005年

8 馮華松;黃友章;段蘊鈾;楊平地;蘭雨;李泳群;;氬氦刀冷凍處理的肺癌細(xì)胞可致敏人骨髓樹突狀細(xì)胞[A];第一屆中國腫瘤微創(chuàng)治療研討會暨中國抗癌協(xié)會腫瘤微創(chuàng)治療專業(yè)委員會成立大會論文集[C];2005年

9 喻倫銀;田鴻生;舒清波;劉銘球;夏東;;超氧化物歧化酶對A_(549)肺癌細(xì)胞一些生物學(xué)特性的影響[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

10 秦建軍;周清華;袁淑蘭;王艷萍;陳曉禾;何金濤;;逆癌酮對肺癌細(xì)胞的生長抑制作用及其機理的初步研究[A];2000全國腫瘤學(xué)術(shù)大會論文集[C];2000年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 文俊 實習(xí)生 范敏 通訊員 羅芳;新技術(shù)“點亮”肺癌細(xì)胞[N];湖北日報;2014年

2 本版編輯邋夏洪平 編譯 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肺科 張新;肺癌細(xì)胞有“致命弱點”[N];健康報;2008年

3 新訊;利用納米技術(shù)數(shù)分鐘可識別九成以上肺癌細(xì)胞[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

4 特約記者 萬初升;“核彈”自動追擊肺癌細(xì)胞[N];家庭醫(yī)生報;2005年

5 記者 何屹;英利用“冷凍療法”殺死肺癌細(xì)胞[N];科技日報;2005年

6 記者 何德功;阻遏肺癌擴散[N];新華每日電訊;2002年

7 ;美證實SLC蛋白能殺死肺癌細(xì)胞[N];中國中醫(yī)藥報;2000年

8 張鑫華;肺癌有望實現(xiàn)早診斷[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2006年

9 楊茜;美發(fā)現(xiàn)肺癌化療藥物產(chǎn)生耐藥性機制[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 ;美發(fā)現(xiàn)殺死肺癌的細(xì)胞蛋白[N];中國中醫(yī)藥報;2002年

，

本文編號：946652