本文關鍵詞：宮頸癌相關生物標記物檢測新方法研究

  更多相關文章： 宮頸癌 人乳頭瘤病毒 E6/E7信使RNA 芯片毛細管電泳 p53蛋白 滾環(huán)擴增技術

【摘要】：在世界范圍內,宮頸癌是女性易發(fā)癌癥之一,在欠發(fā)達地區(qū)宮頸癌的發(fā)病率遠遠高于發(fā)達區(qū)域。分子生物學和流行病學研究證實,人類乳頭瘤病毒對于上皮細胞的持續(xù)感染可以導致子宮頸罹癌或病變。目前,研究人員以發(fā)現(xiàn)超過100多種人乳頭狀瘤病毒類型,這其中,HPV16型普遍在肛門和其它生殖器官的癌變組織中,HPV16連同HPV18、HPV31、HPV33、 HPV35和其它幾種易存在與肛門-生殖器癌變組織的型別,被稱為“高風險”型。相比之下,主要存在于疣和其它病變組織中的人類乳頭瘤病毒類型被指定為“低風險”類型。高危型HPV的持續(xù)感染,導致包括E6、E7基因在內的關鍵癌蛋白編碼基因的過量表達,E6、E7的過表達必將編碼癌蛋白與重要的細胞周期調控分子或腫瘤抑制基因p53相互作用,降解或抑制其活性,導致惡性轉變。盡管HPV是DNA病毒,由于較低的臨床特異性和較弱實際價值,人乳頭狀瘤病毒DNA檢測沒有被廣泛接受為主要篩查手段。在本工作中,NASBA、兩步法RT-PCR和一步法RT-PCR聯(lián)合芯片電泳用于成HPV16E6/E7mRNA的檢測；本工作的另一部分是選擇p53蛋白作為宮頸癌生物標志物,基于滾環(huán)擴增和氯高鐵血紅素/G-四聯(lián)體技術對其進行分析檢測。本研究的主要內容和結論如下：第一章綜述了子宮頸癌和人乳頭瘤病毒之間的關系,簡要介紹和比較了細胞學檢測、HPV DNA檢測和E6/E7mRNA檢測。第二章針對三種不同的核酸擴增技術聯(lián)合芯片電泳對HPV 16 E6/ E7 mRNA檢測做了比較型的研究。這些研究具有高通量、高可靠性的特點,相對于傳統(tǒng)耗時的毛細管電泳或分子信標檢測方法,檢測耗時大大縮短�；诤怂嵝蛄袛U增技術(NASBA)、一步法RT-PCR和兩步法RT-PCR的HPV篩查檢測技術已經建立。相信在進一步修改和完善后,這種方法能夠在肛門-生殖器癌臨床診斷和預后中發(fā)揮作用。第三章p53作為一種腫瘤抑制蛋白、轉錄因子,在細胞生長控制、DNA修復、細胞程序性調亡過程中起著重要的作用。p53被證實與宮頸癌相關,p53蛋白和E6蛋白的結合在宮頸癌的發(fā)生核發(fā)展過程中起著重要作用。在這項工作中,我們計劃設計制造一個簡易、便攜的芯片裝置,以期實現(xiàn)p53蛋白的高敏感性和高選擇性檢測。p53蛋白在微通道中被選擇性捕獲,然后是借助RCA實現(xiàn)目標放大,再借助RCA擴增得到的G-quadruplex結構單元,催化ABTS-hemin-H2O2體系發(fā)光體系,實現(xiàn)信號放大,最后進行比色測定。
【關鍵詞】：宮頸癌 人乳頭瘤病毒 E6/E7信使RNA 芯片毛細管電泳 p53蛋白 滾環(huán)擴增技術
【學位授予單位】：北京化工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 第一章 緒論13-29
• 1.1 宮頸癌和人乳頭瘤病毒13-20
• 1.1.1 E6和E7蛋白與宮頸癌的發(fā)生15-16
• 1.1.2 HPV的檢測16-20
• 1.1.2.1 細胞學檢測16-17
• 1.1.2.2 HPV DNA檢測17-19
• 1.1.2.3 HPV mRNA的檢測19-20
• 1.2 依賴核酸序列擴增技術20-22
• 1.2.1 NASBA概述20
• 1.2.2 NASBA的基本原理20-21
• 1.2.3 NASBA的應用21-22
• 1.3 p53和癌癥22-25
• 1.4 滾環(huán)擴增技術25-27
• 1.4.1 RCA概述26
• 1.4.2 RCA的基本原理26
• 1.4.3 RCA的應用26-27
• 1.5 本論文的立題內容和意義27-29
• 第二章 比較三種不同的核酸擴增技術聯(lián)合芯片毛細管電泳用于HPV16E6/E7 mRNA的檢測29-50
• 2.1 前言29
• 2.2 實驗部分29-36
• 2.2.1 宮頸癌細胞的選擇和培養(yǎng)29-30
• 2.2.2 宮頸癌細胞總RNA提取30-31
• 2.2.3 依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)擴增HPV16 E6/E7 mRNA31-33
• 2.2.4 RNA反轉錄實驗33
• 2.2.5 RT-PCR用于HPV16型E6XE7相關mRNA反轉錄和擴增33-35
• 2.2.6 實驗所需試劑及儀器35-36
• 2.3 結果與討論36-49
• 2.3.1 芯片毛細管電泳(MCE)分離緩沖液的配制37-39
• 2.3.2 總RNA提取質量分析39-40
• 2.3.3 依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)條件優(yōu)化40-42
• 2.3.4 依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)聯(lián)合芯片毛細管電泳(MCE)檢測E6/E7 mRNA特異性和靈敏度42-44
• 2.3.5 兩步法RT-PCR聯(lián)合芯片毛細管電泳(MCE)檢測E6/E7 mRNA44-46
• 2.3.6 一步法RT-PCR聯(lián)合芯片毛細管電泳(MCE)檢測E6/E7 mRNA46-47
• 2.3.7 RT-PCR聯(lián)合芯片毛細管電泳(MCE)檢測HPV18型E6/E7 mRNA47-49
• 2.4 本章小結49-50
• 第三章 基于滾換擴增技術和血晶素/G-四聯(lián)體體系雙官能團比色檢測P53蛋白50-59
• 3.1 前言50-51
• 3.2 實驗部分51-54
• 3.2.1 芯片制備和修飾51-53
• 3.2.2 probe-primer-circle-template制備53
• 3.2.3 滾環(huán)擴增(RCA)和p53蛋白檢測53-54
• 3.3 結果與討論54-58
• 3.3.1 probe-primer-circle-template制備54
• 3.3.2 滾環(huán)擴增(RCA)和P53蛋白檢測54-58
• 3.4 本章小結58-59
• 第四章 結論59-60
• 參考文獻60-68
• 附錄68-69
• 致謝69-70
• 研究成果及發(fā)表的學術論文70-71
• 作者與導師簡介71-72
• 附件72-73

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1 劉全利;宮頸癌相關生物標記物檢測新方法研究[D];北京化工大學;2015年

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本文編號：914045