本文關鍵詞：胞質(zhì)NPM1突變蛋白穩(wěn)定丙酮酸激酶增強白血病細胞有氧糖酵解表型

  更多相關文章： NPM1 基因突變 PKM2 有氧糖酵解 急性髓系白血病

【摘要】：目的:腫瘤細胞的有氧糖酵解能夠促進其惡性轉(zhuǎn)化,目前已知多種基因可參與調(diào)控該過程。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中最常見的基因突變,對AML的發(fā)生、治療以及預后有重要影響。然而,NPM1突變在AML有氧糖酵解表型中的調(diào)控作用尚未闡明。本文探討NPM1突變對AML有氧糖酵解表型的影響及相關分子機制,進一步觀察有氧糖酵解表型對NPM1突變AML細胞體外增殖能力的影響。方法:采用基因過表達的方法,在白血病細胞株THP-1中過表達NPM1 A型突變蛋白(NPM1-mA),觀察NPM1-mA對白血病細胞糖酵解表型的影響。采用慢病毒RNA干擾的方法,感染天然攜帶NPM1-mA的白血病細胞株OCI/AML3后,觀察干擾NPM1-mA對白血病細胞糖酵解表型的影響。qRT-PCR和Western blot方法檢測髓系白血病細胞株中NPM1-mA基因和蛋白的表達。Glucose Assay Kit和Lactate Assay Kit試劑盒檢測培養(yǎng)基中葡萄糖消耗量和乳酸生成量。利用2?,7?-Dichlorofluorescin Diacetate(DCF-DA)探針檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。在OCI/AML3細胞中,利用免疫共沉淀(IP)聯(lián)合質(zhì)譜檢測(MS)技術篩選出與NPM1-mA蛋白相互作用的糖酵解相關蛋白。通過內(nèi)源性co-ip實驗驗證蛋白間的相互作用。免疫熒光實驗驗證npm1-ma與糖酵解相關目的蛋白(pkm2)的亞細胞共定位。進一步利用放線菌酮處理oci/aml3細胞,檢測pkm2的蛋白穩(wěn)定性變化。之后,采用rna干擾和過表達方法調(diào)控pkm2蛋白表達,觀察npm1-ma白血病細胞糖酵解水平的改變。通過cck-8法和克隆形成實驗進一步觀察pkm2對npm1-ma白血病細胞體外增殖能力的影響。結(jié)果:成功建立npm1-ma過表達的thp-1細胞株,npm1-ma組細胞糖酵解水平上升(p0.05),ros水平下調(diào)(p0.05);而干擾npm1-ma的oci/aml3細胞株中,sh-npm1組細胞糖酵解水平下降(p0.05),ros水平上調(diào)(p0.05)。ip聯(lián)合ms篩選出與npm1-ma蛋白相互作用的兩種糖酵解關鍵酶(pfkl和pkm2)。采用westernblot方法在6株白血病細胞株中檢測pfkl和pkm2蛋白表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)pkm2蛋白高表達而pfkl蛋白表達水平難以檢測。細胞內(nèi)co-ip實驗證實了npm1-ma蛋白與pkm2蛋白的相互作用,且二者共定位于細胞質(zhì)中。過表達npm1-ma促進pkm2蛋白水平,而干擾npm1-ma則下調(diào)pkm2蛋白水平,同時細胞內(nèi)pkm2蛋白的穩(wěn)定性下降。此外,干擾oci/aml3細胞株pkm2的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)sh-pkm2組細胞糖酵解水平下降(p0.05),ros水平上調(diào)(p0.05)。若在npm1-ma下調(diào)的oci/aml3細胞株中恢復pkm2的表達,則發(fā)現(xiàn)白血病細胞的糖酵解水平上升(p0.05),ros水平下調(diào)(p0.05)。另外,sh-pkm2組細胞增殖能力和克隆形成能力明顯降低(p0.05),而恢復pkm2表達的flag-pkm2組細胞的細胞增殖能力和克隆形成能力明顯增強(p0.05)。結(jié)論:NPM1-mA參與調(diào)控白血病細胞的高糖酵解表型。移位至胞質(zhì)中的NPM1-mA蛋白可與糖酵解關鍵限速酶PKM2結(jié)合并穩(wěn)定PKM2蛋白分子。PKM2介導的高糖酵解水平增強了白血病細胞的體外增殖能力。靶向PKM2抑制糖酵解水平可能成為攜帶NPM1突變白血病臨床治療研究的一種新策略。
【關鍵詞】：NPM1 基因突變 PKM2 有氧糖酵解 急性髓系白血病
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 第一部分 NPM1突變蛋白參與調(diào)控白血病細胞的有氧糖酵解15-31
• 1 材料與方法15-25
• 2 結(jié)果25-29
• 3 討論29-31
• 第二部分 NPM1突變蛋白穩(wěn)定糖酵解關鍵酶PKM231-44
• 1 材料與方法31-34
• 2 結(jié)果34-41
• 3 討論41-44
• 第三部分 PKM2介導的糖酵解在白血病細胞生長中的作用44-53
• 1 材料與方法44-45
• 2 結(jié)果45-51
• 3 討論51-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻54-58
• 文獻綜述58-67
• 參考文獻63-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章及相關課題68-69

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