本文關鍵詞：HCMV感染上調(diào)人星形膠質(zhì)細胞IGF2分泌對膠質(zhì)瘤細胞生物學行為影響的分子機制

  更多相關文章： HCMV感染 IGF2 星形膠質(zhì)細胞 膠質(zhì)瘤 ATF5

【摘要】：人巨細胞病毒(HCMV)感染和惡性腦膠質(zhì)瘤關系密切。在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中,HCMV的潛伏感染會潛移默化地影響膠質(zhì)瘤細胞的發(fā)展。這種影響途徑主要包括:HCMV感染下的星形膠質(zhì)細胞上調(diào)IGF2表達,進而IGF2蛋白的分泌表達量增加,IGF2分泌蛋白通過與普遍表達在膠質(zhì)瘤細胞表面的IGFI-R結(jié)合,介導膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)MAPK-ATF5通路的活化,最終影響腦膠質(zhì)瘤細胞生物學行為,促進膠質(zhì)瘤細胞增殖、分化,且抑制其凋亡。首先利用q RT-PCR技術檢測感染HCMV前后星形膠質(zhì)細胞內(nèi)IGF2表達量的改變;進而ELISA測定感染前后星形膠質(zhì)細胞IGF2蛋白分泌量的變化;利用免疫熒光技術觀測,與感染了HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞,其胞膜表面磷酸化的IGF-IR表達增多。然后在分子水平上探討HCMV感染通過IGF-IR介導的MAPK-ATF5信號通路,影響膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)部代謝及重要分子物質(zhì)的改變。在細胞水平上研究感染對膠質(zhì)瘤細胞增殖和分化的影響。研究試圖闡明在體內(nèi)潛伏感染的HCMV病毒參與腦膠質(zhì)瘤增殖與分化的分子機制,為治療HCMV持續(xù)性感染的相關疾病提供新藥物靶位和防控新思路。目的:1.檢測感染HCMV前后星形膠質(zhì)細胞IGF2基因的表達和蛋白分泌的改變,研究膠質(zhì)瘤微環(huán)境中HCMV潛伏感染狀態(tài)下,星形膠質(zhì)細胞分泌影響腦腫瘤發(fā)育的相關細胞因子水平變化。2.建立星形膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)瘤細胞的共培養(yǎng)模型,模擬體內(nèi)膠質(zhì)瘤微環(huán)境,對比及研究與HCMV感染的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞和與未被HCMV感染的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞,其胞膜表面分子受體,內(nèi)部細胞信號通路激活和膠質(zhì)瘤細胞生物學行為的改變。方法:1.測定模擬HCMV潛伏感染狀態(tài)所需要的最適MOI值,用最適MOI的HCMV感染人星形膠質(zhì)細胞,q RT-PCR檢測隨著時間的延長,星形膠質(zhì)細胞內(nèi)IGF2基因表達量的改變。ELISA檢測感染后星形膠質(zhì)細胞分泌IGF2的改變。2.建立體外星形膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)模型,利用transwell共培養(yǎng)小室模擬體內(nèi)膠質(zhì)瘤微環(huán)境,上室接種膠質(zhì)瘤細胞,下室接種星形膠質(zhì)細胞。3.共培養(yǎng)體系建立后,HCMV感染星形膠質(zhì)細胞,利用免疫熒光技術激光共聚焦顯微鏡觀測與未感染的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞,與感染了HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞,它們的表面受體IGF-IR磷酸化水平的改變。利用q RT-PCR,Western blot測定其胞內(nèi)MAPK-ATF5信號通路的激活狀態(tài)。同時利用CCK8檢測各組膠質(zhì)瘤細胞增殖,流式細胞術檢測其凋亡率結(jié)果:1.實驗測得當HCMV的m.o.i.=2時即可以很好地維持星形膠質(zhì)細胞的生長狀態(tài)良好,基本不發(fā)生形變,又能持續(xù)性的分泌IGF2,為下一步研究對膠質(zhì)瘤細胞影響的研究奠定基礎。2.HCMV感染的星形膠質(zhì)細胞IGF2基因表達量隨著時間的延長呈遞增趨勢。星形膠質(zhì)細胞外分泌IGF2蛋白的表達量也同步增長。3.建立共培養(yǎng)體系以后,免疫熒光結(jié)果顯示,與感染了HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞表面磷酸化的IGF-IR比例顯著增加。并且隨著共培養(yǎng)時間的延長,磷酸化IGF-IR的比例有逐步遞增的趨勢。與未感染了HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞表面磷酸化IGF-IR比例基本不變,非磷酸化的IGF-IR處于優(yōu)勢地位。4.q RT-PCR以及Western blot驗證了IGF-IR下游MAPK-ATF5信號通路的激活,最終將影響到膠質(zhì)瘤細胞的發(fā)展。5.CCK-8檢測結(jié)果顯示:膠質(zhì)瘤細胞與感染了HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)或者培養(yǎng)液中加入外源性IGF2,可以促進其增殖,且后者作用大于前者。而與未感染HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞增殖明顯落后于以上兩組。流式細胞術檢測結(jié)果顯示:與感染了HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)或者培養(yǎng)液中加入外源性IGF2的膠質(zhì)瘤細胞凋亡率也呈現(xiàn)降低的趨勢,而與未感染HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞凋亡率基本保持不變。結(jié)論:1.HCMV AD169感染人星形膠質(zhì)細胞將上調(diào)IGF2的基因表達,同時也促進了人星形膠質(zhì)細胞外分泌IGF2蛋白增多。2.與感染了HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞,IGF-IR受體被激活,IGF-IR磷酸化水平升高。在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)激活MAPK通路,最終導致了ATF5的高表達。3.MAPK-ATF5通路的激活將會影響膠質(zhì)瘤細胞的生存及生長,提高膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力,減少了膠質(zhì)瘤細胞凋亡,加速了病情的惡化甚至死亡。
【關鍵詞】：HCMV感染 IGF2 星形膠質(zhì)細胞 膠質(zhì)瘤 ATF5
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-9
• 引言9-12
• 第一章 材料12-18
• 1.1 主要儀器設備12
• 1.2 主要實驗試劑及配制12-16
• 1.3 組織標本、細胞來源16-18
• 第二章 方法18-35
• 2.1 復蘇人星形膠質(zhì)細胞18
• 2.2 免疫熒光法檢測人星形膠質(zhì)細胞的純度18
• 2.3 HCMV AD169株毒種的制備和定量18-20
• 2.4 U-87MG星形膠質(zhì)瘤細胞傳代培養(yǎng)的建立20-21
• 2.5 qRT-PCR檢測HCMV感染前后星形膠質(zhì)細胞內(nèi)IGF2和IE2基因表達水平的變化21-24
• 2.6 ELISA測定感染HCMV前后星形膠質(zhì)細胞分泌IGF2的變化24-26
• 2.7 建立星形膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)瘤細胞的共培養(yǎng)體系的建立26-27
• 2.8 共培養(yǎng)體系中U87膠質(zhì)瘤細胞的IGF-IR,KRAS,BRAF,CREB3L2 and ATF5mRNA表達情況27-30
• 2.9 Western Blot檢測共培養(yǎng)體系中U87細胞Phospho-IGF-IR,Phospho-ERK1/2，IGF-IR ，ERK1/2 和ATF5蛋白的表達情況30-32
• 2.10 CCK-8 比色法檢測共培養(yǎng)對U87細胞增殖的影響32
• 2.11 Annexin V/ 7-AAD染色及流式細胞儀檢測共培養(yǎng)后的U87細胞凋亡32-33
• 2.12 免疫熒光檢測共培養(yǎng)前后U87細胞表面IGF-IR和Phospho-IGF-IR表達的改變33-34
• 2.13 統(tǒng)計學分析34-35
• 第三章 結(jié)果35-43
• 3.1 體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞表達的GFAP35
• 3.2 HCMV AD169毒株的定量35
• 3.3 選擇HCMV AD169毒株感染星形膠質(zhì)細胞的最適MOI值35-36
• 3.4 HCMV AD169毒株感染星形膠質(zhì)細胞后IGF2基因表達上調(diào)，，分泌IGF2蛋白增多。36-37
• 3.5 HCMV AD169感染星形膠質(zhì)細胞后使其分泌IGF2蛋白增多37-38
• 3.6 感染HCMV的星形膠質(zhì)細胞和U87膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)引起U87細胞表面受體表達的改變，IGF-IR表達下調(diào)，而Phospho-IGF-IR表達上調(diào)38
• 3.7 與感染了HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的U87膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)ERK/MAPK通路及ATF5的激活38-41
• 3.8 與感染了HCMV的星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的U87細胞增殖活力提高41
• 3.9 流式細胞術檢測各組U87膠質(zhì)瘤細胞凋亡41-43
• 第四章 討論43-46
• 4.1 HCMV感染及膠質(zhì)瘤細胞中ATF5表達對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展起到了至關重要的意義43-44
• 4.2 IGF2和IGF-ⅠR的作用功能及其與神經(jīng)系統(tǒng)的關聯(lián)44
• 4.3 星形膠質(zhì)細胞在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的重要地位44-46
• 第五章 結(jié)論46-47
• 參考文獻47-49
• 文獻綜述49-63
• 參考文獻61-63
• 攻讀學位期間的研究成果63-64
• 致謝64-65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張慈安;魏品康;李勇進;;腫瘤酸性微環(huán)境的研究進展[J];腫瘤;2010年06期

本文編號：895436