本文關(guān)鍵詞：S100A9對宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景和目的S100家族是EF-手型鈣結(jié)合蛋白家族中最大的多基因家族,絕大部分作為鈣受體結(jié)合蛋白發(fā)揮作用,參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成、酶活性的調(diào)節(jié)及細(xì)胞間信號傳導(dǎo)等。該家族中16個成員(包括S100A9)的基因定位于1號染色體長臂2區(qū)1帶(1q21),該區(qū)段穩(wěn)定性較差,易發(fā)生多種染色體重排,從而引起S100基因表達(dá)的失控。近年來發(fā)現(xiàn)S100異常表達(dá)于多種腫瘤組織中,且與疾病的分期和預(yù)后相關(guān)。S100A9(calgranulin B,MRP14)是S100蛋白家族的成員,最初發(fā)現(xiàn)表達(dá)于髓系細(xì)胞分化過程中,且以粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)最高。越來越多研究證實(shí)多種腫瘤中也存在S100A9的高表達(dá);我們前期發(fā)現(xiàn)S100A9促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲、促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果都提示S100A9與腫瘤的發(fā)生發(fā)展較為相關(guān)。但其對腫瘤的作用及其機(jī)制、以及在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義等都尚待探討。宮頸癌發(fā)病率位于女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之首,直接蔓延為其最常見的播散方式,向前侵犯膀胱,向后侵犯直腸。其次,由于宮旁淋巴管豐富,淋巴轉(zhuǎn)移也是其擴(kuò)散的主要途徑。腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移給病人帶來極大的痛苦,甚至威脅生命。因此,明確宮頸癌遷移的具體機(jī)制對于降低患者病死率及改善預(yù)后具有重要意義。用基因芯片檢測宮頸鱗癌和癌旁宮頸組織的差異表達(dá)基因時(shí),發(fā)現(xiàn)s100a9在宮頸鱗癌中的表達(dá)更高,提示s100a9可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此,本研究以宮頸癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象,觀察s100a9對其增殖及轉(zhuǎn)移的影響,并初步探討其分子機(jī)制,為闡明宮頸癌發(fā)生發(fā)展積累實(shí)驗(yàn)依據(jù),也可望為宮頸癌的診斷及治療提供新思路。方法1.下調(diào)和上調(diào)人s100a9基因表達(dá)的工具的制備:1-1干擾人s100a9基因表達(dá)的重組腺病毒adsis100a9及其對照腺病毒adsicontrol的構(gòu)建、包裝:將針對人s100a9基因的干擾序列及其無關(guān)序列(對照)分別插入pses1中,然后轉(zhuǎn)化bj5183,與padeasy進(jìn)行重組,挑選針尖樣大小單克隆菌落,提質(zhì)粒,pacⅠ酶切鑒定后,將pacⅠ酶切后線性化的質(zhì)粒在lipo2000輔助下轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞,進(jìn)行病毒包裝。1-2用hek293細(xì)胞擴(kuò)增所需重組腺病毒:包括adsis100a9、adsicontrol、攜帶人s100a9基因的重組腺病毒ads100a9及其對照adgfp。2.檢測三株宮頸癌細(xì)胞系(siha、caski和hela)中s100a9的內(nèi)源性表達(dá);分別用ads100a9和adsis100a9感染低表達(dá)和高表達(dá)s100a9的hela和siha細(xì)胞,再用rt-pcr和蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn)被感染細(xì)胞中s100a9基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)。3.s100a9對宮頸癌hela和siha細(xì)胞的增殖和遷移的影響:利用ads100a9和adsis100a9分別感染hela和siha細(xì)胞,分別用mtt法、劃痕愈合試驗(yàn)和transwell試驗(yàn)檢測其增殖及遷移能力的變化。4.s100a9對宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)的影響:ads100a9和adsis100a9分別感染于hela和siha細(xì)胞后,蛋白質(zhì)印跡法、免疫熒光檢測emt標(biāo)志物e-cadherin、vimentin的水平變化。5.s100a9對宮頸癌細(xì)胞中wnt/β-catenin信號活性的影響:ads100a9和adsis100a9分別感染hela和siha細(xì)胞后,rt-pcr和蛋白質(zhì)印跡法檢測wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵信號分子β-catenin(全部的及胞核內(nèi)的)以及下游靶基因c-myc、snail和twist的表達(dá)。6.wnt/β-catenin信號通路在s100a9誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的作用:聯(lián)合使用重組蛋白gst-hs100a9和β-catenin的重組干擾腺病毒(adsiβ-catenin)處理hela細(xì)胞,經(jīng)mtt法和transwell試驗(yàn)檢測其增殖和遷移能力的變化。7.wnt/β-catenin信號通路在s100a9誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生emt中的作用:聯(lián)合使用重組蛋白gst-hs100a9和adsiβ-catenin處理hela細(xì)胞,蛋白質(zhì)印跡法檢測emt標(biāo)志物e-cadherin、vimentin水平的變化。結(jié)果1.成功構(gòu)建、包裝和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需的病毒。1-1構(gòu)建s100a9的sirna質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入bj5183細(xì)胞中與padeasy進(jìn)行同源重組,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞后,熒光顯微鏡下可見細(xì)胞中的紅色熒光逐漸增強(qiáng);于7-9d后收集細(xì)胞,反復(fù)凍融以裂解細(xì)胞,3次后收獲adsis100a9;相同方法獲得其對照腺病毒adsicontrol。至此,完成adsis100a9和adsicontrol的包裝。1-2將待擴(kuò)增的病毒ads100a9、adgfp和adsis100a9、adsicontrol感染hek293細(xì)胞,24、36和48小時(shí)后的hek293細(xì)胞中分別可見逐漸增強(qiáng)的綠色熒光和紅色熒光;待80%以上細(xì)胞變圓、少數(shù)細(xì)胞脫落漂浮時(shí)收獲細(xì)胞,凍融裂解,收獲病毒,再進(jìn)行逐輪擴(kuò)增;病毒分裝凍存于-20℃?zhèn)溆谩?.這三株宮頸癌細(xì)胞系中,s100a9的表達(dá)以hela細(xì)胞最低,siha細(xì)胞略高于caski。ads100a9和adgfp感染hela細(xì)胞后,ads100a9組的細(xì)胞中s100a9mrna和蛋白水平顯著高于空白組和gfp組(即adgfp感染組);adsis100a9及adsicontrol感染siha細(xì)胞后,adsis100a9組的細(xì)胞中s100a9mrna和蛋白水平顯著低于空白組和sicontrol組(即adsicontrol感染組)。3.s100a9促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移。3-1s100a9促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖(mtt):1)hela細(xì)胞:按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用ads100a9等處理各組細(xì)胞;第1、2d,三組細(xì)胞之間的od490nm值(od值)無明顯差異;到第3d,空白組、gfp組及s100a9過表達(dá)組的od值分別為0.870±0.124、0.833±0.164和1.257±0.158,s100a9過表達(dá)組的od值顯著高于gfp組(p0.05);2)siha細(xì)胞:三組細(xì)胞在adsis100a9等相應(yīng)處理后,其增殖能力在1d、2d無明顯差異;到第3d,空白組、sicontrol組及s100a9干擾組的od值分別為1.190±0.206、1.113±0.179和0.683±0.066,s100a9干擾組的od值顯著低于sicontrol組(p0.05)。3-2s100a9促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移。1)hela細(xì)胞:劃痕24h后,s100a9過表達(dá)組的劃痕愈合能力顯著高于空白組和gfp組;transwell試驗(yàn)結(jié)果與之一致,即:s100a9過表達(dá)組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(128.67±22.03)個,明顯高于空白組(74.67±14.05)和gfp組(66.00±14.42)個,差異具有顯著性(p0.05);2)siha細(xì)胞:劃痕36h后,s100a9干擾組的劃痕愈合能力明顯低于空白組和sicontrol組;transwell試驗(yàn)結(jié)果與之一致,即:s100a9干擾組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(77.50±7.77)個,明顯低于空白組(182.5±10.61)和sicontrol組(155.50±4.94),差異具有高度顯著性(p0.01)。4.s100a9促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞emt的發(fā)生。蛋白質(zhì)印跡法和細(xì)胞免疫熒光檢測的結(jié)果一致顯示:s100a9過表達(dá)的hela細(xì)胞內(nèi)的e-cadherin水平低于gfp組(p0.05),vimentin水平則高于gfp組(p0.01);s100a9干擾組的siha細(xì)胞內(nèi)e-cadherin高于sicontrol組(p0.01),而vimentin水平則低于sicontrol組(p0.05)。5.s100a9增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞中wnt/β-catenin信號活性。1)s100a9過表達(dá)的hela細(xì)胞內(nèi)總的及胞核內(nèi)的β-catenin水平均高于gfp組,分別是gfp組的1.43倍和2.12倍(p0.01),并且該通路的下游靶基因c-myc、snail和twist的mrna水平也均高于gfp組(p0.05;p0.01;p0.05);2)s100a9表達(dá)下調(diào)的siha細(xì)胞內(nèi)總的及胞核內(nèi)的β-catenin水平則低于siControl組,分別為siControl組的27%(P0.001)和50%(P0.05),該通路下游的c-myc、Snail和Twist的mRNA水平也均低于siControl組(P0.01;P0.01;P0.001)。6.Wnt/β-catenin信號通路參與介導(dǎo)S100A9促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的作用。Adsiβ-catenin可下調(diào)β-catenin的表達(dá),聯(lián)合使用GST-h S100A9和Adsiβ-catenin處理Hela細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)β-catenin的下調(diào)能夠部分抑制S100A9誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞增殖和遷移。7.Wnt/β-catenin信號通路參與介導(dǎo)S100A9促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞EMT的作用。聯(lián)合使用GST-hS100A9和Adsiβ-catenin處理Hela細(xì)胞,蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示β-catenin的下調(diào)能夠部分阻斷S100A9引起的E-cadherin的下調(diào)和Vimentin的上調(diào)。結(jié)論1.S100A9促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移。2.S100A9促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT。3.S100A9激活宮頸癌細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號通路。4.S100A9對Wnt/β-catenin信號通路的激活作用參與介導(dǎo)S100A9的促宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和EMT的活性。
【關(guān)鍵詞】：S100A9 宮頸癌 增殖 遷移 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) Wnt/β-catenin信號通路
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-6
• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-20
• 前言20-23
• 參考文獻(xiàn)21-23
• 第一部分 重組腺病毒Adsi S100A9的制備及所需重組腺病毒的擴(kuò)增23-39
• 1 材料與方法23-32
• 2 結(jié)果32-36
• 3 討論36-37
• 4 小結(jié)37
• 參考文獻(xiàn)37-39
• 第二部分 S100A9對宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移的影響39-45
• 1 材料與方法39-41
• 2 結(jié)果41-43
• 3 討論43-44
• 4 小結(jié)44
• 參考文獻(xiàn)44-45
• 第三部分 S100A9促宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移的作用機(jī)制45-58
• 1 材料與方法45-48
• 2 結(jié)果48-54
• 3 討論54-55
• 4 小結(jié)55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 全文總結(jié)58-59
• 文獻(xiàn)綜述59-69
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 致謝69-70
• 碩士期間發(fā)表的論文70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：880532