本文關(guān)鍵詞：不依賴CAR的腎癌組織特異性復制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定

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【摘要】：目的:構(gòu)建攜帶腎癌特異性啟動子碳酸酐酶IX(Carbonic Anhydrase IX,CAIX)和人源化綠色熒光蛋白(humanized renilla reniformis Green Fluorescent Protein,hrGFP-1)報告基因的不依賴CAR的復制缺陷型5型重組腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1,建立檢測腎癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)的新方法,為臨床治療提供理論依據(jù)。方法:分別雙酶切pShuttle-CMV-hrGFP-1、pShuttle-CAIX-E1A獲得hrGFP-1目的基因片段和載體基因片段,T4 DNA連接酶過夜連接,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CAIX-E1A-hr GFP-1,搖菌并提取質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定,鑒定證實構(gòu)建正確的質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶切線性化,與骨架質(zhì)粒AdEasy-1/f11p依次轉(zhuǎn)化入感受態(tài)BJ5183細菌,通過同源重組技術(shù)構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1。將經(jīng)PCR、酶切鑒定證實構(gòu)建正確的重組腺病毒質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5a細菌擴增、保存。陽性質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切后,轉(zhuǎn)染HEK293細胞,獲得重組腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1,經(jīng)4輪擴增后純化病毒,檢測其滴度。結(jié)果:經(jīng)PCR、酶切鑒定,證實重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CAIX-E1A-hrGFP-1、重組腺病毒質(zhì)粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hrGFP-1構(gòu)建正確;經(jīng)4輪擴增后純化,測定重組腺病毒的滴度為2.36×109pfu/ml。結(jié)論:不依賴CAR的腎癌組織特異性復制缺陷型重組腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1構(gòu)建成功,為檢測腎癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細胞提供新的方法,對早期發(fā)現(xiàn)腎癌的惡性侵襲、判斷腎癌分期、預后、指導個體化治療及療效評價等具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：腎癌 循環(huán)腫瘤細胞 碳酸酐酶IX啟動子 人源化綠色熒光蛋白 柯薩奇受體 重組腺病毒
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文縮寫索引6-9
• 前言9-12
• 材料和方法12-19
• 1.1 實驗材料12-15
• 1.1.1 質(zhì)粒、菌株及細胞12-13
• 1.1.2 主要實驗試劑13
• 1.1.3 實驗設備及儀器13-14
• 1.1.4 主要溶液及配制14-15
• 1.2 實驗方法15-19
• 1.2.1 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CAIX-E1A-hrGFP-1 的構(gòu)建及鑒定15-17
• 1.2.2 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定17-18
• 1.2.3 重組腺病毒包裝及擴增18-19
• 結(jié)果19-22
• 2.1 重組穿梭質(zhì)粒鑒定19-20
• 2.1.1 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CAIX-E1A-hrGFP-1 的PCR鑒定19-20
• 2.2 重組腺病毒質(zhì)粒鑒定20-21
• 2.2.1 重組腺病毒質(zhì)粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hrGFP-1 的PCR鑒定20-21
• 2.2.2 重組腺病毒質(zhì)粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hrGFP-1 的酶切鑒定21
• 2.3 重組腺病毒的包裝、擴增、提純及滴度測定21-22
• 討論22-27
• 結(jié)論27-28
• 參考文獻28-34
• 綜述34-41
• 參考文獻38-41
• 研究生期間的發(fā)表論文及參與課題41-42
• 致謝42

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本文編號：818783