本文關鍵詞：miR-30a靶向EYA2基因對肺腺癌細胞惡性生物學表型的影響

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【摘要】：肺癌是中國癌癥死亡的主要原因,其中非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌中常見的一種組織學類型,約占肺癌的80%左右,五年生存率僅為15%左右。目前對NSCLC的分子發(fā)病機制還知之甚少,還有待于更多的研究。 microRNAs (miRNAs)是一類進化上保守的非編碼小RNA,在轉錄后水平微調基因的表達。越來越多的證據顯示miR-30a可作為一個抑癌基因抑制多種腫瘤細胞的生長,在少數幾種腫瘤細胞中還發(fā)現具有癌基因的特征。EYA2是eyes absent(EYA)蛋白家族成員之一,已報導能夠促進乳腺癌細胞的侵襲、遷移、增殖和轉化過程。然而,niR-30a和EYA2在NSCLC發(fā)生過程中的生物學功能和作用機制還未完全清楚。 本文通過Targetscan和miRanda預測,EYA2很可能是miR-30a作用的一個靶點；進一步采用免疫印跡(western blot)對EYA2在NSCLC細胞株中的表達水平進行了定量檢測,發(fā)現EYA2僅在肺腺癌A549細胞中的表達水平顯著上調；實時熒光定量PCR (qRT-PCR)對niR-30a在肺腺癌細胞和組織中的表達水平進行了檢測,發(fā)現miR-30a在肺腺癌A549細胞和14例石蠟包埋的肺腺癌組織中的表達水平均顯著下調；雙熒光素酶報告基因實驗以及在A549細胞和BEAS-2B細胞中轉染miR-30a mimic和inhibitor驗證了miR-30a直接作用于EYA2mRNA3' UTR而抑制其蛋白的表達水平；劃痕實驗(wound-healing assay)、 MTS細胞活力檢測、Transwell細胞侵襲實驗及流式細胞周期分析對miR-30a靶向EYA2是否能夠影響A549細胞的惡性生物學表型做了初步評估,結果發(fā)現miR-30a過表達抑制了細胞的遷移和侵襲,對增殖和周期進程無影響,而EYA2siRNA對細胞的侵襲、遷移、增殖和周期進程都起到了顯著的抑制作用。上述結果表明了niR-30a能夠靶向調控肺腺癌A549細胞中EYA2蛋白的表達水平,且這種調控關系很可能與細胞遷移和侵襲相關,對增殖和周期進程無影響。
【關鍵詞】：NSCLC miR-30a EYA2 遷移 侵襲
【學位授予單位】：云南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 主要~.略詞簡表9-10
• 第1章 前言10-23
• 1、肺癌概述10-13
• 1.1 肺癌流行病學10
• 1.2 肺癌分類與分期10-11
• 1.3 肺癌的遺傳易感性11-12
• 1.4 肺癌的分子發(fā)病機制12-13
• 2、miRNA概述13-19
• 2.1 miRNA的命名13-14
• 2.2 miRNA的成熟過程及作用機制14
• 2.3 miRNA的定量檢測14-15
• 2.4 miRNA靶基因的預測15
• 2.5 miRNA的功能分析15-16
• 2.6 miRNA與人類癌癥16-17
• 2.7. miRNA與NSCLC17-19
• 3、EYA蛋白家族概述19-21
• 3.1 EYA蛋白的結構與活性19-20
• 3.2 EYA蛋白的細胞功能20
• 3.3 EYA蛋白與人類癌癥20-21
• 4、本文立項依據21-23
• 第2章 材料與方法23-36
• 1、主要儀器設備23
• 2、主要實驗試劑23-26
• 3、實驗材料26-27
• 4、實驗內容與方法27-35
• 4.1 細胞培養(yǎng)27-28
• 4.2 Western Blot檢測細胞中靶基因的表達水平28-30
• 4.2.1 溶液配制28
• 4.2.2 western blot實驗流程28-30
• 4.3 莖環(huán)引物(stem-loop primer)設計30
• 4.4 總RNA提取30-31
• 4.4.1 細胞總RNA提取30-31
• 4.4.2 組織總RNA提取31
• 4.5 qRT-PCR檢測細胞和組織中miRNA的表達水平31
• 4.6 細胞瞬時轉染31
• 4.7 雙熒光素酶報告實驗31-33
• 4.7.1 主要試劑配制31-32
• 4.7.2 質粒構建32-33
• 4.7.3 轉染級別質粒抽提33
• 4.7.4 細胞培養(yǎng)與共轉染33
• 4.7.5 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測33
• 4.8 細胞惡性生物學表型的檢測33-35
• 4.8.1 Wound-Healing實驗檢測細胞遷移33-34
• 4.8.2 基于PI染色的流式細胞周期分析34
• 4.8.3 MTS法檢測細胞增殖34
• 4.8.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲34-35
• 5、數據分析35-36
• 第3章 實驗結果與分析36-50
• 1、預測miR-30a在EYA2 mRNA 3’UTR是否有互補結合位點36
• 2、Western Blot檢測NSCLC細胞株中EYA2的蛋白水平36-37
• 3、qRT-PCR檢測miR-30a在肺腺癌中的表達水平37-41
• 3.1 總RNA提取37-38
• 3.2 A549細胞和14例肺腺癌組織中miR-30a表達水平的實時熒光定量檢測38-41
• 3.2.1 引物信息38-39
• 3.2.2 qRT-PCR39-40
• 3.2.3 數據分析40-41
• 4、miR-30a靶向作用于EYA2 mRNA3’UTR41-43
• 4.1 EYA2-3’UTR-wild type及-mutant序列的設計與合成41
• 4.2 載體構建及測序41-43
• 4.3 數據分析43
• 5、miR-30a水平和EYA2表達的相關性分析43-45
• 6、miR-30a mimics或EYA2 siRNAs能抑制A549細胞的遷移能力45-46
• 7、miR-30a mimics對A549細胞的周期進程沒有影響46
• 8、miR-30a mimics對A549細胞的增殖沒有影響46-48
• 9、miR-30a mimics或EYA2 siRNAs能抑制A549細胞的侵襲能力48-49
• 10、miR-124、miR-155、miR-140不能靶向調控A549細胞中EYA2的表達49-50
• 第4章 討論50-54
• 參考文獻54-63
• 致謝63

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 茹松偉;申衛(wèi)紅;楊鵬程;趙屹;邵啟祥;;microRNA靶基因預測算法研究概況及發(fā)展趨勢[J];生命科學;2007年05期

2 景花;宋沁馨;周國華;;MicroRNA定量檢測方法的研究進展[J];遺傳;2010年01期

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本文編號：816655