本文關(guān)鍵詞：來氟米特對腎癌細胞增殖和凋亡的影響

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【摘要】：背景：來氟米特(Leflunomide, LEF)為合成序號為HWA2486的異惡唑類藥物,又名N-(4-三氟-甲苯)-5-甲基異嗯唑-4-咪唑羧酰胺,分子結(jié)構(gòu)為C12H9F3N2O2,分子量270.2。是一種以治療類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)為主的抗增殖活性免疫抑制劑。丙二酸次氮酰胺(A771726)是LEF在細胞內(nèi)發(fā)揮藥效的代謝產(chǎn)物。A771726可逆地抑制二氫乳氫酸脫氫酶(DHODH)的活性,DHODH失活將影響活化淋巴細胞的嘧啶合成過程。除此之外,A771726還會抑制NF-κB的激活,影響?zhàn)じ椒肿拥谋磉_,例如細胞間粘附因子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1)等。與某些抗腫瘤藥物機制類似。我們推測LEF對腎癌細胞的增殖和凋亡可能具有一定的影響作用。研究內(nèi)容：探究腎癌細胞用LEF處理后,其增殖和凋亡的變化情況。并深入分析LEF對腎癌細胞的作用機制。研究方法：腎癌細胞株786-0和Caki-2作為實驗材料,用不同濃度的LEF(50、100、200gM)處理不同的時間(24、48、72 h),加0.1%的DMSO的組作為對照。1.LEF對腎癌細胞增殖的影響的檢測采用MTS實驗,EdU摻入實驗和細胞克隆形成實驗。LEF對腎癌細胞內(nèi)相關(guān)周期蛋白的影響檢測采用流式細胞儀檢測細胞周期實驗和蛋白印跡實驗。2.LEF對腎癌細胞凋亡的影響檢測采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡實驗,LEF對腎癌細胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白的表達的影響的檢測采用蛋白印跡實驗,LEF對腎癌細胞自噬的影響的檢測采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗。3.蛋白印跡實驗,細胞免疫化學實驗和實時熒光定量PCR實驗分析LEF處理Caki-2細胞后,β-catenin, c-Myc, Wnt3a,Wnt1等的表達,采用蛋白印跡實驗和流式細胞技術(shù)檢測使用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路制劑或改變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin的量后腎癌細胞對LEF敏感性的變化,采用基因芯片技術(shù)進一步檢測和驗證LEF對腎癌細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因表達的影響。研究結(jié)果：1.LEF對腎癌細胞增殖的影響MTS實驗結(jié)果表明,不同濃度的LEF作用于Caki-2細胞和786-0細胞48 h后,細胞活力都劑量依賴性降低,但Caki-2細胞對LEF的作用更為敏感。LEF濃度≥100μM時,細胞活力顯著降低,并且具有時間依賴性。Caki-2細胞用不同濃度的LEF處理48 h后,用EdU摻入法檢測DNA的合成,以檢測細胞的增殖活力,結(jié)果顯示,陽性細胞的數(shù)量以劑量依賴的方式顯著減少。細胞克隆形成實驗進一步顯示,在藥物處理過程中,LEF濃度超過50μM時幾乎完全抑制細胞克隆的形成。LEF處理后,細胞內(nèi)周期相關(guān)蛋白CyclinA, CyclinD1和CDK2表達下降,而作為CDK的抑制因子,p21蛋白表達增加,Caki-2細胞發(fā)生S期細胞周期阻滯。2.LEF引發(fā)腎癌細胞凋亡和自噬LEF能夠介導(dǎo)腎癌細胞發(fā)生凋亡,在200μM的濃度下,凋亡最顯著,此時PARP-1和Caspase-3出現(xiàn)了剪切片段。Bcl-2和APE/REF-1這些抗凋亡蛋白的表達降低,而另一抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達在藥物處理后幾乎不受影響,同時Bax作為促凋亡蛋白表達增加。此外,轉(zhuǎn)染LC3-GFP質(zhì)粒的Caki-2細胞經(jīng)LEF處理后,原本彌漫的LC3-GFP在細胞質(zhì)中成簇積累,呈現(xiàn)斑塊狀。表明細胞發(fā)生了自噬。在50μM的LEF組雖然不能觀察到明顯的細胞凋亡現(xiàn)象,卻能觀察到明顯的自噬現(xiàn)象。蛋白印跡實驗也檢測到P62蛋白隨LEF濃度增加而減少以及表達升高的自噬蛋白LC3-Ⅱ。3.LEF對腎癌細胞作用機制的研究結(jié)果(1)高濃度LEF影響Caki-2細胞內(nèi)β-catenin的表達水平。這種影響主要表現(xiàn)為改變P-catenin蛋白的量,而不是其在mRNA水平上的表達。β-catenin基因下游的一個癌基因c-Myc,不但在蛋白水平上表達減少,在mRNA水平上表達也顯著下調(diào)。除此之外,LEF處理Caki-2細胞一定的時間后,可以看到細胞內(nèi)的β-catenin蛋白出核,并且在細胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)濃聚點狀分布。以上這些實驗數(shù)據(jù)充分表明了LEF可以在腎癌細胞內(nèi)抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。(2)LEF與蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(CHX)共同處理加強了Caki-2細胞內(nèi)β-catenin蛋白的降解程度,泛素化抑制劑MG-132與LEF共處理Caki-2細胞,能夠反轉(zhuǎn)LEF對β-catenin蛋白表達的抑制作用,但自噬抑制劑HCQ卻不能。說明在LEF處理后蛋白降解作用使Caki-2細胞內(nèi)β-catenin蛋白數(shù)量降低。蛋白印跡實驗表明,100μM和200μM的LEF處理有效地抑制了Caki-2細胞內(nèi)AKT激酶的磷酸化。因此,LEF誘導(dǎo)β-catenin蛋白的降解可歸因于AKT激酶的磷酸化被抑制。(3)LEF處理后Caki-2細胞內(nèi)Wnt3a表達升高。Wnt1表達略有下降,Wnt5a表達基本不發(fā)生變化。Wnt信號的分泌抑制劑IWP-2與LEF聯(lián)合處理Caki-2細胞能夠增強LEF對細胞的毒性作用,即LEF和IWP-2共同處理極大地提高了Caki-2細胞的凋亡水平。LEF單獨處理時,Caki-2細胞內(nèi)相關(guān)蛋白β-catenin, c-Myc和CyclinD1的表達下降程度沒有聯(lián)合加藥時大。所以,細胞可能在LEF處理后上調(diào)Wnt3a的表達來減少藥物的毒性作用,即過表達Wnt3a來抗衡細胞的抑增殖和促凋亡作用。(4)基因芯片結(jié)果顯示,100μM的LEF處理48 h以后,Caki-2細胞內(nèi)Wnt受體FZD10的表達降低超過800倍,Fzdl和Fzd2的mRNA水平也有所降低。結(jié)論：LEF處理后,腎癌細胞生長變緩慢,同時發(fā)生了自噬和細胞凋亡,表現(xiàn)出了LEF對腎癌細胞的毒性作用。LEF之所以能夠抑制腎癌細胞的生長,促進細胞的凋亡,可能是因為腎癌細胞內(nèi)的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被抑制了。高濃度LEF處理組細胞內(nèi)β-catenin蛋白從細胞核出來,點狀聚集在細胞質(zhì)中,LEF抑制AKT激酶的磷酸化而使β-catenin蛋白水解,抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活,LEF通過影響β-catenin的穩(wěn)定性及其定位的變化,使細胞周期相關(guān)蛋白、Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受體蛋白FZD10,FZD2表達下降。但同時,高濃度的LEF又上調(diào)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的配體Wnt3a在mRNA上的表達水平以抵抗LEF的抗增殖和促凋亡效應(yīng)。高濃度的LEF可以通過抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的活化,降低細胞活力,促進細胞發(fā)生凋亡。因此,LEF可能對腎癌有潛在的治療作用。
【關(guān)鍵詞】：Leflunomide 腎癌細胞 增殖 凋亡
【學位授予單位】：浙江師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• ABSTRACT8-15
• 縮略語及中英文對照15-16
• 綜述 Wnt信號通路與腫瘤的關(guān)系16-24
• 1 Wnt信號途徑16-18
• 1.1 Wnt信號通路主要成員16-17
• 1.2 Wnt信號通路主要活化方式17-18
• 1.2.1 Wnt經(jīng)典通路17
• 1.2.2 Wnt非經(jīng)典通路17-18
• 2 Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和癌癥的關(guān)系18-21
• 3 Wnt3a在癌細胞中的表達21
• 4 Wnt3a抑制或促進癌細胞生長21-22
• 5 Wnt3a在體內(nèi)影響腫瘤的生長22
• 6 Wnt3a在癌癥的作用22-23
• 6.1 Wnt3a調(diào)節(jié)癌癥內(nèi)基因表達22-23
• 6.2 Wnt3a由基因/蛋白調(diào)節(jié)23
• 7 展望23-24
• 1 背景24-26
• 2 實驗材料26-29
• 2.1 細胞株26
• 2.2 質(zhì)粒26
• 2.3 主要藥物、試劑及材料26-28
• 2.4 儀器與設(shè)備28-29
• 3 實驗方法29-41
• 3.1 細胞培養(yǎng)與傳代29-30
• 3.2 細胞的活力測定實驗(MTS法)30
• 3.3 Edu摻入實驗(EdU incorporation assay)30-31
• 3.4 細胞克隆形成實驗(Colony formation assay)31-32
• 3.5 流式細胞儀檢測細胞周期(Flow cytometry analysis)32
• 3.6 流式細胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)檢測細胞凋亡32-33
• 3.7 實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)33-35
• 3.8 蛋白免疫印跡(Western blot)35-37
• 3.9 細胞免疫熒光(Immunofluorescence)37-39
• 3.10 轉(zhuǎn)染(DNA interfection)39
• 3.11 基因芯片(Gene Expression Microarray)39
• 3.12 質(zhì)粒擴增39-40
• 3.13 統(tǒng)計學分析40-41
• 4 實驗結(jié)果41-54
• 4.1 LEF對腎癌細胞的增殖抑制作用41-45
• 4.2 LEF對腎癌細胞凋亡和自噬的影響45-47
• 4.3 LEF對腎癌細胞作用機制的研究47-54
• 4.3.1 LEF抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路47-49
• 4.3.2 LEF通過抑制AKT的磷酸化誘導(dǎo)β-catenin蛋白的降解49-51
• 4.3.3 LEF上調(diào)Wnt3a維持經(jīng)典Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑51-53
• 4.3.4 LEF下調(diào)Fzd10表達53-54
• 5 討論54-56
• 6 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-67
• 致謝67-68
• 攻讀學位論文期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄68-70

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