本文關鍵詞：FoxP3對甲狀腺乳頭狀癌中NIS表達的影響及機制研究

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【摘要】：背景甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常見的內分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,其預后通常較好,十年生存率約達90%。甲狀腺癌術后,放射性碘治療是其常規(guī)后續(xù)治療手段,但一些病人表現出對放射性碘治療耐受。目前有大量文獻指出病人這種對放射性碘治療的耐受與位于甲狀腺細胞膜的鈉碘轉運體(sodium iodine symporter,NIS)表達下調有關。NIS介導了碘由細胞外向細胞內的轉運,為甲狀腺激素的合成提供了原料,其表達主要受TSH的調控,TSH不僅能促進NIS的表達水平,而且能使其正確定位于細胞膜上。除TSH外,轉化生長因子β1(Transforming growth factor,TGF-β1),雌激素和碘在NIS的調節(jié)上也起著重要作用;其中,TGF-β1主要通過拮抗TSH的生物學效應來發(fā)揮其抑制甲狀腺功能及NIS表達的作用。Smads家族是一類細胞內信號轉導因子,主要位于TGF-β信號通路的下游發(fā)揮作用。TGF-β1首先結合到細胞表面一種特異性激酶(TGF-βtype II receptor,TβR-II)上,從而導致了TβR-I的激活,后者又使R-Smad2和R-Smad3磷酸化,磷酸化的R-Smad2和R-Smad3繼而與Smad4共同轉移到細胞核中調節(jié)相應基因的表達。叉頭狀轉錄因子P3(Forkhead box P3,Fox P3)是CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Tregs)生長和分化的重要調節(jié)因子。一直以來都認為Fox P3僅限定于Treg細胞中特異性表達,直到Hanz在胰腺癌細胞中亦發(fā)現了它的表達,接下來在多種癌細胞株中都發(fā)現其有不同程度的表達。Fox P3在腫瘤細胞中能夠模仿其在Treg細胞中的功能,它通過促進免疫抑制性細胞因子如TGF-β1分泌來抑制腫瘤特異性T細胞,從而使腫瘤逃離機體的免疫監(jiān)視。此外,有研究顯示Fox P3高表達和病人對放射性碘治療抵抗有關。由于病人對放射性碘治療的耐受與NIS表達下調有關,且Fox P3在多種腫瘤中都能促進TGF-β1分泌,而TGF-β1又是NIS表達強有力的抑制因子,因此推測Fox P3可能通過誘導TGF-β1信號通路的激活來下調NIS的表達。在本研究中,采用免疫組織化學和熒光定量PCR檢測90例甲狀腺乳頭狀癌標本和40例正常甲狀腺組織中Fox P3和NIS的表達。此外,本研究組成性激活型(Constitutively active,CA)Fox P3過表達慢病毒載體來上調Fox P3的表達及活性,觀察在甲狀腺乳頭狀癌細胞中Fox P3對NIS表達水平的影響。目的1.探討Fox P3與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征及NIS表達的關系;2.觀察Fox P3對人甲狀腺乳頭狀癌細胞中NIS表達的影響,并對其機制進行初步探討。方法1.采用免疫組織化學和熒光定量PCR檢測90例甲狀腺乳頭狀癌標本和40例取自癌對側葉的正常甲狀腺組織中Fox P3和NIS的表達。2.人甲狀腺乳頭癌細胞株TPC-1于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用不同濃度的人重組TGF-β1(1,5,10 ng/m L)處理后,Real-time PCR檢測NIS m RNA的表達,Western blot檢測其蛋白水平的表達。3.構建含組成性激活型(Constitutively active,CA)Fox P3編碼序列的慢病毒載體(LV-CA-Fox P3)及空慢病毒載體(LV-NC-GFP),并轉染于TPC-1,倒置熒光顯微鏡觀察GFP的表達,流式細胞儀檢測轉染效率。4.將細胞分為對照(NC)組,過表達Fox P3(LV-CA)組及空病毒載體(LV-NC)組,Real-time PCR檢測Fox P3和TGF-β1的m RNA表達;Western blot檢測Fox P3,TGF-β1及TGF-β1通路下游重要成員TβR-I,Smad3和p Smad3的蛋白表達;免疫熒光檢測Fox P3,TβR-I和Psmad3的表達;ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液的TGF-β1水平。5.將細胞分為對照組,LV-CA組,LV-CA加不同濃度的TGF-β1單克隆抗體組(1μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)以及LV-NC組,Real-time PCR檢測六組細胞NIS m RNA的表達,Western blot檢測其蛋白的表達。結果1.免疫組化結果顯示Fox P3在甲狀腺乳頭狀癌中的陽性率為74%,而在正常組織中均為陰性表達,且Fox P3與甲狀腺外侵犯及淋巴結轉移(P0.05)有關。2.在正常甲狀腺組織中NIS主要定位于細胞膜,在腫瘤組織中其表達顯著減少,尤其在Fox P3陽性的樣本中,并且這些低表達的NIS主要定位于胞漿中。3.免疫組化結果顯示甲狀腺乳頭癌中Fox P3陽性患者的NIS表達陽性率顯著低于Fox P3陰性患者(P0.05)。Real-time PCR結果顯示甲狀腺乳頭癌中Fox P3陽性患者NIS的m RNA水平顯著低于Fox P3陰性患者(P0.05)。4.與對照組相比,隨著培養(yǎng)基中TGF-β1濃度的增加,NIS的m RNA和蛋白表達均逐漸減少;當TGF-β1的濃度達到最大(10 ng/m L)時,NIS的m RNA和蛋白含量分別下降至對照組的6倍和2倍。5.倒置熒光顯微鏡觀察結果顯示LV-CA和LV-NC組細胞中表達大量的GFP,而未轉染組細胞不表達。流式細胞儀顯示對照組,LV-CA-Fox P3組和LV-NC組的GFP陽性率即轉染效率分別為0.2%,99.3%和99.3%。6.與對照組相比,LV-CA組Fox P3和TGF-β1的m RNA和蛋白表達顯著增加(P0.05);ELISA結果顯示與對照組相比,LV-CA組細胞上清液中TGF-β1的分泌顯著增加(P0.05);Western blot結果顯示LV-CA組TβR-I和p Smad3的蛋白表達較對照組顯著增加(P0.05),而Smad3無明顯變化。7.免疫熒光結果顯示,Fox P3在LV-CA組細胞中大量表達,且主要位于細胞核中,而在正常組和LV-NC組細胞中Fox P3的表達量則很低。與正常組和LV-NC組細胞相比,LV-CA組細胞的TβR-I和p Smad3表達水平顯著增強,而Smad3的表達在三組細胞間無統(tǒng)計學差異。8.與NC組相比,LV-CA-Fox P3組NIS的m RNA和蛋白表達水平均顯著降低(P0.05),但隨著TGF-β1單克隆抗體濃度的不斷增加,NIS的m RNA及膜蛋白表達均逐漸恢復至接近正常。結論1.Fox P3在甲狀腺乳頭狀癌中的高表達與甲狀腺腺外侵犯及淋巴結轉移有關,且其高表達可能下調NIS的水平;2.甲狀腺乳頭狀癌中Fox P3對NIS的下調通過TGF-β1/Smad信號通路介導。
【關鍵詞】：甲狀腺乳頭癌 叉頭狀轉錄因子P3 鈉碘轉運體 TPC-1細胞 轉化生長因子β1 Smad蛋白家族
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R736.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文縮略詞14-16
• 前言16-19
• 1 材料與方法19-33
• 2 結果33-35
• 3 討論35-38
• 4 結論38-39
• 附圖39-47
• 參考文獻47-50
• 綜述 叉頭狀轉錄因子P3和甲狀腺乳頭狀癌的關系50-71
• 參考文獻62-71
• 個人簡歷71
• 在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果71-72
• 致謝72

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