線粒體自噬在紅系白血病細(xì)胞中的作用
本文關(guān)鍵詞:線粒體自噬在紅系白血病細(xì)胞中的作用
更多相關(guān)文章: ATG7 經(jīng)典自噬 RAB9A 非經(jīng)典自噬 線粒體自噬
【摘要】:目的:研究紅系白血病細(xì)胞中,是否存在非經(jīng)典自噬,以及非經(jīng)典自噬在紅系白血病細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和應(yīng)激反應(yīng)方面的作用,闡明其與經(jīng)典自噬之間的關(guān)系,及其在線粒體降解過程中的作用,為理解白血病細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)提供細(xì)胞學(xué)新依據(jù)。方法:(1)通過使用CRISPR/Cas9技術(shù),構(gòu)建Atg7敲除的K562細(xì)胞系。(2)通過臺(tái)盼蘭染色細(xì)胞計(jì)數(shù)、Annexin V/PI流式染色(Flow Cytometry,FCM)和細(xì)胞集落分析K562細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化能力的變化。(3)通過透射電鏡技術(shù)TEM和線粒體染色流式分析Atg7-/-的K562細(xì)胞中線粒體、ROS的變化情況,同時(shí)確認(rèn)在Atg7缺失的情況下,細(xì)胞中是否存在自噬體狀結(jié)構(gòu)。(4)使用線粒體自噬的誘導(dǎo)劑CCCP處理野生型和Atg7-/-K562細(xì)胞,通過線粒體流式染色和Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中線粒體數(shù)量的變化情況。(5)通過Western Blot技術(shù)檢測(cè)非經(jīng)典自噬的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量,分析Atg7-/-K562細(xì)胞中非經(jīng)典自噬過程的狀態(tài)。(6)使用非經(jīng)典自噬抑制劑BFA和敲低非經(jīng)典自噬關(guān)鍵基因RAB9A,分析當(dāng)兩種自噬同時(shí)受到抑制的情況下,線粒體自噬的發(fā)生情況。(7)使用Comet Assay和Western Blot技術(shù)檢測(cè)在細(xì)胞在經(jīng)歷電離輻射的情況下,兩種自噬在DNA修復(fù)過程中的作用。結(jié)果:(1)成功使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Atg7-/-K562細(xì)胞系。(2)Atg7的缺失會(huì)導(dǎo)致K562生長(zhǎng)速度變慢,細(xì)胞周期阻滯在G2/M期以及分化潛能降低,但不會(huì)改變細(xì)胞中線粒體數(shù)量和ROS的水平。(3)在Atg7-/-K562細(xì)胞中,能夠觀察到雙層膜包裹的自噬體狀結(jié)構(gòu),同時(shí),Atg7的缺失會(huì)導(dǎo)致非經(jīng)典自噬通路的增強(qiáng)。(4)CCCP誘導(dǎo)的線粒體自噬的發(fā)生并不依賴于Atg7。(5)加入非經(jīng)典自噬抑制劑BFA、敲低非經(jīng)典自噬關(guān)鍵基因RAB9A,線粒體自噬不能正常的發(fā)生。(6)同時(shí)抑制經(jīng)典自噬和非經(jīng)典自噬,K562細(xì)胞在代謝壓力的情況下,表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡、ROS水平升高。(7)非經(jīng)典自噬可能通過RAD50在DNA修復(fù)過程中發(fā)揮作用。結(jié)論:在紅系白血病細(xì)胞系K562中,同時(shí)存在經(jīng)典自噬和非經(jīng)典自噬,當(dāng)經(jīng)典自噬被阻斷后,非經(jīng)典自噬起到一定程度的補(bǔ)償作用。但同時(shí),細(xì)胞內(nèi)的一些重要事件,如線粒體自噬的發(fā)生主要通過非經(jīng)典自噬。本研究從自噬的視角,理解白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),為白血病的臨床治療提供了數(shù)據(jù)參考。
【關(guān)鍵詞】:ATG7 經(jīng)典自噬 RAB9A 非經(jīng)典自噬 線粒體自噬
【學(xué)位授予單位】:蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號(hào)】:R733.7
【目錄】:
- 中文摘要4-6
- Abstract6-9
- 前言9-11
- 材料與方法11-21
- 一、材料11-13
- 二、方法13-21
- 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-32
- 一、敲除ATG7的K562細(xì)胞系構(gòu)建21-22
- 二、ATG7敲除引起K562細(xì)胞G_2/M周期阻滯和分化能力減弱22-24
- 三、線粒體自噬的發(fā)生不依賴于ATG724-25
- 四、線粒體降解依賴于非經(jīng)典型自噬25-30
- 五、非經(jīng)典型自噬夠控制ROS水平,降低細(xì)胞凋亡率,,促進(jìn)DNA輻射損傷修復(fù)30-32
- 討論32-34
- 參考文獻(xiàn)34-39
- 綜述:非經(jīng)典自噬及線粒體自噬的研究進(jìn)展39-47
- 參考文獻(xiàn)43-47
- 碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文47-48
- 附錄48-49
- 中英文縮略詞匯表49-51
- 致謝51-52
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本文編號(hào):813486
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