本文關(guān)鍵詞：PD-Ll分子在腫瘤相關(guān)巨噬細胞介導(dǎo)肺癌免疫逃逸中的作用

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【摘要】：近年來腫瘤免疫治療研究突飛猛進:機體免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視清除腫瘤細胞的作用,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中扮演極其重要的角色。而腫瘤的免疫治療與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān),腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞本身、間質(zhì)細胞、微血管以及腫瘤浸潤細胞,如樹突狀細胞、巨噬細胞等共同構(gòu)成。作為腫瘤免疫發(fā)生的場所,腫瘤微環(huán)境中存在眾多與腫瘤免疫相關(guān)的因素,包括細胞因子的負性調(diào)節(jié)作用,抑制性免疫調(diào)節(jié)細胞Treg、抑制性配體受體反應(yīng)以及腫瘤微環(huán)境T細胞代謝活性的負調(diào)節(jié)等。研究顯示,負性協(xié)同刺激分子PD-L1是近年來備受關(guān)注的免疫分子,PD-1/PD-L1信號通路激活可抑制腫瘤局部微環(huán)境CD4+T、CD8+T細胞的增殖和活化,免疫效應(yīng)降低,從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,促進腫瘤生長。本文著重分析了PD-L1分子在腫瘤微環(huán)境中相關(guān)免疫細胞、腫瘤細胞上的表達,探討其調(diào)節(jié)機制和生物學意義,為研究其介導(dǎo)肺癌免疫逃逸的機制提供新的證據(jù)。一、PD-L1分子在腫瘤相關(guān)巨噬細胞上的表達【目的】探討惡性胸水中腫瘤相關(guān)巨噬細胞上PD-L1的表達及其臨床意義。【方法】收集蘇州大學附屬第一醫(yī)院呼吸科2013年10月到2014年10月期間收治的76例胸水患者臨床資料。肺癌組52例,其中腺癌32例,鱗癌20例,另取結(jié)核性胸膜炎組24例作為研究對照組。收集胸水,采用ficoll密度梯度離心法獲取胸水單個核細胞(PEMC),流式細胞術(shù)檢測PEMC細胞表面腫瘤相關(guān)巨噬細胞上PD-L1、B7-H4的表達�！窘Y(jié)果】肺癌惡性胸水與結(jié)核性胸水相比,PEMC細胞表面CD68+PD-L1+(30.16±16.64%vs 14.09±11.89,P0.01)、CD68+B7-H4+(16.97±10.32%vs 7.17±5.52%,P0.01)細胞及CD68+B7-H4+PD-L1+比例較高(11.05±9.51%vs 3.99±5.03%,P0.01)。在肺鱗癌和腺癌中,PEMC細胞中上述三種細胞群體CD68+PD-L1+(28.73±15.03%vs 32.44±19.13,P=0.440)、CD68+B7-H4+(17.83±10.73%vs16.58±12.35%,P=0.701)及CD68+B7-H4+PD-L1+(10.06±7.43%vs12.63±12.17%,P=0.348)比例未見差異(P值均大于0.05)。【小結(jié)】肺癌惡性胸水PEMC細胞中CD68+PD-L1+、CD68+B7-H4+、CD68+B7-H4+PD-L1+細胞比例均明顯高于結(jié)核性胸膜炎組,對鑒別肺癌惡性胸水及結(jié)核性胸水具有一定的應(yīng)用價值。二、腫瘤相關(guān)巨噬細胞對肺癌細胞上PD-L1分子表達的調(diào)節(jié)及其生物學意義【目的】研究腫瘤相關(guān)巨噬細胞對肺癌細胞膜表面PD-L1分子表達的調(diào)節(jié)作用,并探討其生物學意義。【方法】(1)采用惡性胸水及胸水中腫瘤相關(guān)巨噬細胞培養(yǎng)上清(TAMs上清)培養(yǎng)肺癌細胞(A549細胞),流式細胞術(shù)檢測A549細胞膜表面PD-L1表達,Transwell小室檢測A549細胞侵襲能力的改變。(2)收集惡性胸水,采用ficoll密度梯度離心法獲取胸水PEMC,流式細胞術(shù)檢測PEMC細胞群中TAMs細胞內(nèi)IL-6、IL-10、TNF-α以及INF-γ的表達。(3)采用IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ刺激A549細胞后,流式細胞術(shù)檢測A549細胞膜表面PD-L1表達。(4)應(yīng)用Western blot法檢測IFN-γ刺激A549細胞后p-ERK、p-AKT以及p-Stat3的表達變化。(5)抑制ERK、AKT、Stat3信號途徑,予IFN-γ刺激72h,檢測A549細胞膜表面PD-L1的表達水平變化。(6)加入PD-1融合蛋白與IFN-γ誘導(dǎo)的A549細胞膜膜表面PD-L1分子發(fā)生配基化,采用CCK-8法檢測細胞的增殖、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的改變以及Transwell小室檢測細胞侵襲能力的變化。(7)應(yīng)用RNAi干擾技術(shù),沉默A549細胞PD-L1分子表達后,采用CCK-8法檢測A549細胞的增殖、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的改變以及Transwell小室檢測細胞侵襲能力的變化�！窘Y(jié)果】(1)惡性胸水及胸水中TAMs上清刺激A549細胞后,其表面PD-L1表達均有升高,細胞的侵襲能力明顯增強。(2)惡性胸水PEMC中TAMs內(nèi)IL-10低表達,為2.76%,而IL-6、TNF-α以及INF-γ的表達均有較高表達,分別為:30.1%、40.2%、12.5%。(3)加入INF-γ刺激A549細胞后,其細胞膜表面PD-L1明顯上調(diào),而加入IL-6、IL-10、TNF-α后細胞膜表面PD-L1沒有明顯改變。(4)IFN-γ刺激A549細胞后p-AKT以及p-Stat3的表達增加,而p-ERK的表達未有明顯改變。(5)分別抑制ERK、AKT、Stat3信號途徑后,再給予IFN-γ刺激,A549細胞上PD-L1的表達水平分別為93.6%、43.8%和25.9%,表明抑制AKT、Stat3信號途徑可阻斷IFN-γ誘導(dǎo)的肺癌細胞表面PD-L1表達。(6)PD-1融合蛋白與A549細胞膜上誘導(dǎo)表達的PD-L1分子發(fā)生配基化后,隨著PD-1融合蛋白濃度升高,細胞的增殖逐漸增加,凋亡逐漸減少,侵襲能力增強。(7)應(yīng)用RNAi干擾技術(shù),干擾PD-L1分子表達后,細胞增殖減少,凋亡增加,侵襲能力減弱。【小結(jié)】胸水中腫瘤相關(guān)巨噬細胞通過分泌IFN-γ上調(diào)A549細胞膜上PD-L1的表達,該過程需要PI3K/AKT、JAK/Stat3信號通路的參與。肺癌細胞膜上PD-L1分子的誘導(dǎo)性高表達,具有抗凋亡、促增殖的作用,細胞漿PD-L1分子在維系肺癌細胞的侵襲特性方面具有重要作用。
【關(guān)鍵詞】：肺癌 腫瘤微環(huán)境 腫瘤相關(guān)巨噬細胞 細胞因子 PD-L1 信號通路
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-17
• 參考文獻14-17
• 第一部分：PD-L1 分子在腫瘤相關(guān)巨噬細胞上的表達17-26
• 一、材料和方法17-19
• 二、實驗結(jié)果19-20
• 三、討論20-22
• 參考文獻22-26
• 第二部分：腫瘤相關(guān)巨噬細胞對肺癌細胞上PD-L1 分子表達的調(diào)節(jié)及其生物學意義26-57
• 一、材料和方法26-37
• 二、實驗結(jié)果37-49
• 三、討論49-53
• 參考文獻53-57
• 本課題研究結(jié)論57-58
• 展望58-59
• 綜述59-66
• 參考文獻62-66
• 縮略詞表及注釋66-68
• 攻讀學位期間公開發(fā)表論文68-69
• 本課題獲得基金資助69-70
• 致謝70-71

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本文編號：794969