本文關鍵詞：抗人胃癌干細胞功能性單抗的研究

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【摘要】：第一部分抗人胃癌干細胞功能性單抗的篩選鑒定胃癌在我國發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的第二位,一直對人類生命健康造成嚴重威脅。導致胃癌高死亡率的根本原因是手術、放療、化療后仍發(fā)生高比例的轉移、復發(fā),且發(fā)生轉移復發(fā)的胃癌幾乎都耐藥。然而,現有的臨床治療手段對轉移復發(fā)后的胃癌療效甚微,胃癌死亡率多年來仍舊居高不下。近年來,有關腫瘤干細胞的最新研究表明,腫瘤干細胞是造成腫瘤轉移、復發(fā)、耐藥的根本原因。因此,靶向腫瘤干細胞治療腫瘤轉移、復發(fā)、耐藥的新策略,有望降低腫瘤死亡率,成為當今腫瘤研究的新熱點。目前尚未見到有關靶向胃癌干細胞治療的研究報道。本課題研究旨在篩選鑒定獲得能靶向胃癌干細胞的功能性單抗,通過體內、外功能研究證明功能性抗體靶向胃癌干細胞能有效治療胃癌,從而為治療胃癌的轉移、復發(fā)、耐藥提供有應用價值的后續(xù)抗體前藥。本實驗在前期研究中,從人胃癌組織中分離含有腫瘤干細胞的胃癌細胞,免疫小鼠后,采用本室建立的大容量功能性單抗庫技術制備了庫容3120個克隆的雜交瘤單抗庫。在此基礎上,本研究首先采用活細胞ELISA技術篩選該單抗庫3120個克隆的雜交瘤上清,獲得了482株能同時與胃癌細胞SNU-5和BGC-823兩種胃癌細胞膜反應陽性的雜交瘤克隆。為了獲得抗人胃癌干細胞的單抗,采用含腫瘤干細胞比例高的SNU-5 Sphere細胞進行活細胞ELISA法復篩482株陽性單抗,結果顯示其中144株單抗上清與SNU-5 Sphere細胞的結合反應的OD值(0.5-1.2)顯著高于親本細胞(0.2～0.4),表明這些單抗可能是抗人胃癌干細胞單抗。為了進一步確定這些單抗是抗人胃癌干細胞單抗,我們采用無血清甲基纖維素成球抑制實驗檢測了144株單抗能否抑制腫瘤干細胞自我更新能力的成球生長的功能。結果發(fā)現,其中64株單抗能不同程度地抑制SNU-5中腫瘤干細胞的成球生長,抑制率達10-52%,證明這64株單抗不僅是抗人胃癌干細胞的單抗,而且可能是還具有抑制胃癌干細胞功能的功能性單抗。為了進一步驗證64株單抗是抗人胃癌干細胞的功能性單抗,我們從64株候選單抗中挑選了10株單抗在2種胃癌干細胞模型中,采用流式活細胞免疫熒光、無血清甲基纖維素成球抑制、活細胞ELISA單抗技術進行了進一步鑒定。結果發(fā)現,10株單抗的陽性細胞在胃癌Sphere細胞中的比例升高,均有不同程度富集,表明這些單抗具有腫瘤干細胞自我更新能力。同時發(fā)現10株單抗與胃癌干細胞標志物CD90、CD44陽性的胃癌干細胞均有不同比例的共染,且共染陽性細胞的比例在Sphere細胞中都明顯富集(1.3-31.4倍),表明10株單抗均能識別人胃癌干細胞并與之呈陽性反應,證實這些單抗都是抗人胃癌干細胞的單抗。成球抑制實驗結果表明10株單抗對2種胃癌細胞的干細胞均有不同程度的抑制作用,抑制率達16.3-45.2%。是具有功能的胃癌干細胞單抗。至此,我們至少篩選鑒定獲得10株抗胃癌干細胞的功能性單抗。第二部分抗人胃癌干細胞單抗25G5的研究在前面10株抗人胃癌干細胞單抗研究結果中發(fā)現,其中單抗25G5在胃癌Sphere細胞中的陽性比例高(17.1%),富集倍數也高,與人胃癌干細胞標志物CD90、CD44共染比例最高、富集比例最高(31.4倍)。抑制人胃癌干細胞成球的功能性也最好(抑制率達31.3～45.2%),這些結果表明25G5單抗在10株單抗中,腫瘤干細胞特性最強,抑制胃癌干細胞功能最強。因此,我們選擇25G5單抗進行腫瘤干細胞特性、體外功能及體內靶向人胃癌干細胞治療胃癌的系統(tǒng)研究。通過無血清擴大培養(yǎng)25G5單抗雜交瘤,收集上清,采用Protein G親和純化法,從無血清上清中純化25G5單抗。首先,我們對25G5單抗識別結合的陽性細胞的腫瘤干細胞特性進行了檢測分析。已有的研究證明腫瘤干細胞具有很強的自我更新、高侵襲、耐藥能力以及體內高致瘤性等特征。采用雙色活細胞免疫熒光檢測,發(fā)現25G5單抗識別的抗原與人胃癌干細胞標志物CD90、CD44均共表達共定位于人胃癌干細胞膜上,證明25G5單抗是抗人胃癌干細胞單抗。采用流式分選技術,分選25G5+、25G5-和假分選細胞,檢測分析在無血清培養(yǎng)基的成球率表明,25G5-細胞的成球率(21.4%)顯著高于25G5-細胞(12.3%)和親本細胞(16.1%),P值0.05,表明25G5單抗陽性細胞具有較強的腫瘤干細胞自我更新能力。用流式分選細胞進行的Transwell細胞侵襲實驗、耐藥實驗,結果表明,25G5+細胞的侵襲能力(244.5)較25G5”細胞(122.4)和親本細胞(143.2)顯著增強。25G5+細胞對順鉑化療藥的耐藥性(IC50 0.285μg/ml)較25G5-細胞(IC50 0.094μg/ml)和親本細胞(IC50 0.155μg/ml)顯著升高。鑒于腫瘤干細胞體內高致瘤性是評價腫瘤干細胞的金標準,我們將細胞接種裸鼠體內觀察其致瘤性,發(fā)現25G5-細胞的致瘤性較25G5-細胞高50倍以上,較親本細胞高25倍以上。以上這些研究結果證明25G5單抗識別的細胞是人胃癌干細胞,具有腫瘤干細胞的所有特征。即25G5是識別人胃癌干細胞的單抗。采用無血清甲基纖維素成球抑制,Transwell細胞侵襲和細胞耐藥等實驗在兩種人胃癌干細胞模型中系統(tǒng)研究了25G5單抗的體外功能。結果顯示,25G5單抗在0.125mg/ml-2mg/ml的抗體濃度下對SNU-5細胞中干細胞的成球生長均有抑制作用,其抑制率為22.8～46.4%(P0.05),且有明顯的抗體劑量依賴關系。同樣對BGC-823胃癌細胞中的干細胞的成球生長抑制率為17.542.5%。表明25G5具有顯著抑制胃癌干細胞自我更新能力的功能。Transwell侵襲實驗的結果顯示,25G5單抗對含有高比例胃癌干細胞的SNU-5的Sphere細胞的侵襲功能有明顯的抑制作用,抑制率為26.658.4%(P0.05)。細胞耐藥實驗的結果顯示,25G5單抗能顯著降低人胃癌干細胞的耐藥性,且有明顯抗體劑量相關性,在抗體濃度達到1mg/ml時,干細胞的耐藥性下降約1.3倍(IC50值由0.341 μg/ml下降至0.153μg/ml)。以上這些結果證明25G5單抗能顯著抑制人胃癌干細胞的自我更新、侵襲和耐藥的功能,是一株抗人胃癌干細胞的功能性單抗。為了探討25G5單抗在體內靶向胃癌干細胞能否有效治療人胃癌,我們用純化的25G5單抗進行體內靶向裸鼠移植瘤的動物試驗研究,為了科學評價結果,我們首先建立了適合25G5單抗的含有高比例胃癌干細胞的自發(fā)性高肺轉移的動物模型SNU-5-V13。將SNU-5-V13的Sphere細胞接種裸鼠前肢腋下的皮下后,再經腹腔注射25G5抗體藥物進行治療。動物試驗設9組,每周治療2次,共計治療10次。其間觀察測定記錄腫瘤體積描繪腫瘤生長曲線,計算腫瘤生長體積的抑制率和P值。綜上所述,本研究從3120個克隆的胃癌單抗雜交瘤庫中篩選獲得了64株抗人胃癌干細胞單抗,初步證明有10株單抗是具有抑制胃癌干細胞功能的功能性單抗,挑選其中的1株單抗25G5進行的系統(tǒng)性研究證明,25G5單抗識別的陽性細胞具有較強胃癌干細胞干性特征,確實是一株抗人胃癌干細胞的單抗,同時該單抗還能顯著地抑制胃癌干細胞的自我更新、高侵襲、高耐藥的體外功能,體內靶向胃癌干細胞能有效治療小鼠的人胃癌移植瘤,具有開發(fā)為靶向胃癌干細胞治療胃癌的抗體靶向藥物的應用潛力。
【關鍵詞】：人胃癌細胞 腫瘤干細胞 單克隆抗體 靶向治療
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 個人簡歷3-7
• 摘要7-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-17
• 第一部分：抗人胃癌干細胞功能性單抗的篩選17-45
• 一、實驗材料與方法17-26
• 二、研究設計與技術路線26-27
• 三、實驗結果27-44
• (一) 人胃癌干細胞細胞系模型的篩選27-31
• 1. 4種人胃癌細胞系無血清培養(yǎng)成球率分析27
• 2. 流式細胞術檢測胃癌干細胞標志物27-29
• 3 PKH26染色確認人胃癌細胞系中存在腫瘤干細胞29-31
• (二) 人胃癌單抗庫的制備及篩選31-44
• 1 人胃癌單抗庫的制備31
• 2 人胃癌單抗庫的初篩31-32
• 2.1 SNU-5活細胞ELISA篩選胃癌細胞陽性單抗31
• 2.2 BGC-823活細胞ELISA篩選胃癌細胞陽性單抗31-32
• 3 人胃癌干細胞陽性單抗的篩選32-33
• 3.1 Sphere細胞篩選胃癌干細胞單抗32
• 3.2 成球抑制實驗篩選胃癌干細胞功能性單抗32-33
• 4 10株胃癌干細胞功能性單抗的進一步鑒定33-44
• 4.1 10株單抗類和亞類及分泌表達量的測定33-34
• 4.2 活細胞ELISA檢測10株單抗與胃癌細胞系中結合反應34-35
• 4.3 流式檢測單抗陽性細胞在SNU-5Sphere細胞中富集35-36
• 4.4 流式檢測單抗陽性細胞BGC-823Sphere細胞中富集36-38
• 4.5 10株單抗與胃癌干細胞標志物CD90的共染分析38-40
• 4.6 10株單抗與胃癌干細胞標志物CD44共染分析40-41
• 4.7 10株單抗對胃癌干細胞成球生長的抑制作用41-43
• 4.8 WB分析10株單抗與胃癌干細胞中抗原結合的特異性43-44
• 第一部分小結44-45
• 第二部分：抗人胃癌干細胞單抗25G5的研究45-76
• 一、實驗材料與方法45-57
• 二、研究設計與技術路線57-58
• 三、實驗結果58-75
• (一) 25G5單抗雜交瘤的培養(yǎng)及抗體純化58-59
• 1 單抗雜交瘤細胞的無血清擴大培養(yǎng)及上清收集58
• 2 25G5單抗的純化、純度及活性鑒定58-59
• (二) 25G5單抗識別細胞的腫瘤干細胞特性的鑒定59-65
• 1 25G5單抗與標志物在胃癌干細胞膜上共定位分析59-60
• 2 25G5單抗識別的陽性細胞具有腫瘤噶細胞自我更新能力60-62
• 3 25G5單抗識別的陽性細胞具有更強的侵襲能力62-63
• 4 25G5單抗識別的陽性細胞具有腫瘤干細胞高耐藥性特征63-64
• 5 25G5單抗識別的陽性細胞具有在體內的高致瘤性特征64-65
• (三) 單抗25G5體外功能的研究65-70
• 1 單抗25G5對胃癌干細胞自我更新能力的影響65-66
• 2 單抗25G5對胃癌干細胞細胞侵襲能力的影響66-68
• 3 單抗25G5降低胃癌干細胞對順鉑化療藥的耐藥性68-70
• (四) 單抗25G5靶向胃癌干細胞治療胃癌的動物體內試驗研究70-75
• 1 靶向胃癌干細胞治療胃癌體內試驗動物模型的研究70-74
• 1.1 流式細胞術檢測SNU-5-V13中25G5~+干細胞的存在70-71
• 1.2 單抗25G5對SNU-5-V13體外自我更新能力的影響71-72
• 1.3 SNU-5-V13細胞系裸鼠移植瘤模型的建立72-74
• 2 單抗25G5靶向胃癌干細胞治療胃癌的動物體內試驗74-75
• 第二部分小結75-76
• 討論76-80
• 結論80-81
• 參考文獻81-83
• 中英文縮略表83-84
• 綜述84-91
• 參考文獻88-91
• 致謝91-93
• 攻讀學位期間發(fā)表論文93

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4 ;研究揭示腦癌干細胞如何爭奪營養(yǎng)[J];生物學通報;2013年10期

5 吳生華;俞繼衛(wèi);姜波健;;胃癌干細胞的研究現狀[J];腹部外科;2009年06期

6 陸旭偉;凡杰;;腎癌干細胞研究進展[J];現代腫瘤醫(yī)學;2010年01期

7 葉夏;黃正接;;胃癌干細胞研究進展[J];齊齊哈爾醫(yī)學院學報;2011年04期

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9 ;《自然-神經科學》:研究揭示腦癌干細胞如何爭奪營養(yǎng)[J];現代生物醫(yī)學進展;2013年34期

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本文編號：786820