本文關鍵詞：Irx5過表達乳腺癌細胞株的構建及其細胞功能分析

  更多相關文章： Irx5基因 慢病毒載體 遷移 侵潤 基因過表達

【摘要】：Irx5(Iroquois homeobox gene family)基因是伊洛魁同源盒基因家族中的一員,該家族有6個成員。有報道表明Irx家族的一些成員與人多種腫瘤的發(fā)生有關,其中Irx1和Irx4已被證實分別是胃癌和前列腺癌轉移的抑制基因;而Irx5基因在人、鼠高轉移乳腺癌細胞系中均低表達,且其表達水平與乳腺癌患者癌細胞的轉移潛力呈明顯負相關,暗示Irx5可能是一個乳腺癌轉移的抑制基因。為了進一步研究Irx5基因在乳腺癌細胞發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中的作用。我們構建了Irx5基因過表達MDA-MB-231乳腺癌細胞株,利用細胞增殖、遷移和侵襲等體外實驗確認Irx5基因對乳腺癌細胞轉移的抑制作用。研究結果如下:(1)根據(jù)GenBank中人Irx5基因序列(NM_005853),設計一對引物,采用RT-PCR從293T細胞的cDNA中成功擴增出Irx5基因的編碼區(qū)序列;純化后的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后,與同樣酶切線性化的慢病毒載體(PEB-3xflag-GP)連接,獲得重組慢病毒表達質粒(PEB-3xflag-GP-Irx5);經(jīng)酶切、電泳檢測、測序后發(fā)現(xiàn)重組慢病毒表達質粒(PEB-3xflag-GP-Irx5)中的插入片段與GenBank中Irx5基因編碼區(qū)序列完全一致,表明重組過表達質粒構建成功。(2)將成功構建的重組慢病毒質粒和包裝質粒共轉染293T細胞,生產(chǎn)重組慢病毒,病毒懸液梯度稀釋法測得病毒滴度為3~8×108 TU/mL;用病毒感染高轉移的人MDA-MB-231乳腺癌細胞。感染48 h后用2.5μg/m L嘌呤霉素篩選穩(wěn)定過表達Irx5基因的細胞株,經(jīng)2~3周的篩選,Western blotting法檢測了Irx5基因在細胞中的表達情況。結果顯示用重組慢病毒感染的乳腺癌細胞中有外源Irx5基因的過表達,而用空載體病毒感染(對照)的乳腺癌細胞中無外源Irx5基因的表達,說明已成功構建了Irx5基因過表達的乳腺癌細胞株,Irx5基因在乳腺癌細胞中可以穩(wěn)定表達。(3)通過MTT、克隆形成、細胞劃痕和Transwell實驗研究了Irx5基因對乳腺癌細胞增殖、轉移和侵潤能力的影響。與對照細胞相比,MTT和克隆形成實驗結果表明Irx5基因過表達的乳腺癌細胞增殖能力下降;細胞劃痕和Transwell遷移實驗中Irx5基因過表達的乳腺癌細胞遷移能力降低;Transwell侵襲實驗中Irx5基因過表達的乳腺癌細胞侵襲能力降低;由此說明Irx5過表達抑制乳腺癌細胞的增殖、轉移和侵襲。Irx5基因這一抑制作用的證實,不僅為進一步闡明其分子機制和轉錄調控的網(wǎng)絡通路奠定了基礎,而且為轉移性乳腺癌的分子診斷、個體化治療和靶向藥物治療等提供了一個新的思路。
【關鍵詞】：Irx5基因 慢病毒載體 遷移 侵潤 基因過表達
【學位授予單位】：淮北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-19
• 1.1 乳腺癌轉移相關基因的研究進展11-19
• 1.1.1 乳腺癌轉移促進基因12-14
• 1.1.2 乳腺癌轉移抑制基因14-16
• 1.1.3 乳腺癌轉移的分子機制16-19
• 第二章 Irx5過表達乳腺癌細胞株的構建19-39
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 載體和細胞19-20
• 2.1.2 儀器20
• 2.1.3 主要試劑20-21
• 2.2 方法21-33
• 2.2.1 Irx5過表達乳腺癌細胞株的篩選流程21
• 2.2.2 Irx5基因重組慢病毒載體構建21-27
• 2.2.3 慢病毒包裝27-30
• 2.2.4 Irx5過表達乳腺癌細胞株的篩選30-33
• 2.3 結果與分析33-37
• 2.3.1 PCR擴增結果33
• 2.3.2 菌落PCR鑒定結果33-34
• 2.3.3 重組慢病毒載體陽性克隆雙酶切結果34-35
• 2.3.4 陽性克隆測序結果35-36
• 2.3.5 慢病毒滴度測定36-37
• 2.3.6 Western blotting檢測外源Irx5基因表達的結果37
• 2.4 小結37-38
• 2.5 討論38-39
• 第三章 Irx5基因對乳腺癌細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響39-47
• 3.1 材料39-40
• 3.1.1 儀器39
• 3.1.2 主要試劑與耗材39-40
• 3.2 方法40-42
• 3.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代40
• 3.2.2 MTT法檢測細胞增殖40
• 3.2.3 克隆形成實驗40-41
• 3.2.4 細胞劃痕實驗41
• 3.2.5 Transwell細胞遷移實驗41-42
• 3.2.6 Transwell細胞侵襲實驗42
• 3.3 結果與分析42-45
• 3.3.1 MTT實驗檢測乳腺癌細胞的增殖42-43
• 3.3.2 克隆形成實驗檢測乳腺癌細胞的增殖43
• 3.3.3 細胞劃痕實驗檢測乳腺癌細胞遷移能力43-44
• 3.3.4 Transwell實驗檢測乳腺癌細胞遷移能力44-45
• 3.3.5 Transwell實驗檢測乳腺癌細胞侵襲能力45
• 3.4 小結45-46
• 3.5 討論46-47
• 總結47-48
• 參考文獻48-57
• 攻讀碩士學位期間出版或發(fā)表的論著、論文57-58
• 致謝58

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 賀蘭湘,張先林;家族性乳腺癌遺傳易感基因研究現(xiàn)狀[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;2000年05期

2 裴曉華,馬秀t，

本文編號：775311