本文關(guān)鍵詞：用于單細(xì)胞分析的微流控芯片研究及其在腫瘤干細(xì)胞分離鑒定方面的應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 微流控芯片 單細(xì)胞 數(shù)字PCR 腫瘤干細(xì)胞 分離鑒定

【摘要】：細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位,傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)研究依賴(lài)于大量細(xì)胞(103-104個(gè)),把群體值作為測(cè)量結(jié)果。然而研究發(fā)現(xiàn),即使是生活在同一環(huán)境、同一組織中的同種細(xì)胞,其在基因表達(dá)水平上也存在著很大差異。細(xì)胞之間存在異質(zhì)性,而群體分析會(huì)掩蓋細(xì)胞個(gè)體間的差異,因此,開(kāi)發(fā)一種能有效分析單細(xì)胞組分的技術(shù)勢(shì)在必行。微流控芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)樣、單細(xì)胞捕獲、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分選、細(xì)胞裂解以及分析檢測(cè)多個(gè)步驟整合在一起,并且具有高通量、小型化、平行化、自動(dòng)化、便攜化等優(yōu)勢(shì),為單細(xì)胞研究提供了一個(gè)可行的技術(shù)平臺(tái)。本論文研制了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的單細(xì)胞分析微流控芯片,微流控芯片的主體采用了聚二甲基硅氧烷(poly(dimethylsiloxane), PDMS)高聚物材料,利用PDMS高聚物具有良好氣體溶解性的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)負(fù)壓自吸式自動(dòng)進(jìn)樣,使所研制的芯片像臨床的真空采血管一樣方便使用,不需輔助設(shè)備控制流路。將數(shù)千個(gè)細(xì)胞單獨(dú)分隔到不同的微反應(yīng)室,不再互相干擾,也不易發(fā)生漏檢,實(shí)現(xiàn)高通量單細(xì)胞快速分離；隨即將分離開(kāi)的單細(xì)胞直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR),節(jié)省了時(shí)間。每個(gè)反應(yīng)室容積5-10 nL,上千反應(yīng)室的一塊芯片也僅需試劑數(shù)微升,節(jié)省試劑。本研究取得了以下創(chuàng)新性結(jié)果：(1)成功研制了集單細(xì)胞捕獲、裂解、RT-PCR反應(yīng)于一體的微流控芯片,并能用于單細(xì)胞數(shù)字PCR研究,通過(guò)研究不同單個(gè)A549腫瘤干細(xì)胞中CD133和管家基因GAPDH的基因表達(dá)驗(yàn)證了細(xì)胞之間存在異質(zhì)性。(2)基于所研制的單細(xì)胞微流控芯片實(shí)現(xiàn)了一步法快速鑒定腫瘤干細(xì)胞,利用腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133對(duì)肺癌A549細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。本文中所研制的微流控芯片易于操作、敏感度高(單細(xì)胞)、準(zhǔn)確性好(可計(jì)數(shù))、省試劑(數(shù)微升/芯片),適合于普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞等稀少細(xì)胞的快速鑒定。為腫瘤干細(xì)胞的研究提供了一種單細(xì)胞分離與特異性鑒定的新工具,可用于鑒定腫瘤干細(xì)胞的分子遺傳特征和特異標(biāo)志物,解決腫瘤千細(xì)胞特異性鑒定困難的問(wèn)題。為腫瘤學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù),為臨床病情判斷、病程監(jiān)控和預(yù)測(cè),指導(dǎo)治療等奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：微流控芯片 單細(xì)胞 數(shù)字PCR 腫瘤干細(xì)胞 分離鑒定
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R73-3;Q813
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-40
• 1.1 課題背景12-13
• 1.2 微流控芯片操縱單元13-25
• 1.2.1 單細(xì)胞捕獲13-17
• 1.2.1.1 重力離心13-15
• 1.2.1.2 流體動(dòng)力學(xué)15-16
• 1.2.1.3 介電電泳16-17
• 1.2.2 細(xì)胞分選17-21
• 1.2.2.1 熒光激發(fā)分選18-19
• 1.2.2.2 磁力分選19-20
• 1.2.2.3 層流分選20-21
• 1.2.3 細(xì)胞裂解21-25
• 1.2.3.1 化學(xué)裂解21-22
• 1.2.3.2 機(jī)械裂解22-23
• 1.2.3.3 激光裂解23-24
• 1.2.3.4 熱裂解24
• 1.2.3.5 電裂解24-25
• 1.3 微流控技術(shù)在單細(xì)胞研究方面的應(yīng)用25-33
• 1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 1.3.2 單細(xì)胞基因表達(dá)分析26-28
• 1.3.2.1 RT-qPCR26-27
• 1.3.2.2 高通量微流控單細(xì)胞數(shù)字PCR27-28
• 1.3.3 單細(xì)胞基因組測(cè)序28-31
• 1.3.4 單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析31-33
• 1.4 單細(xì)胞微流控系統(tǒng)商品化現(xiàn)狀33-34
• 1.4.1 C1單細(xì)胞自動(dòng)制備系統(tǒng)33
• 1.4.2 DEPArray系統(tǒng)33-34
• 1.5 本文研究?jī)?nèi)容34-36
• 1.6 參考文獻(xiàn)36-40
• 第2章 單細(xì)胞微流控芯片的研制及其在單細(xì)胞數(shù)字PCR方面的應(yīng)用40-64
• 2.1 引言40-42
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分42-52
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與裝置42
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑42-43
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)操作43-52
• 2.2.3.1 單細(xì)胞微流控掩膜的設(shè)計(jì)43-45
• 2.2.3.2 模具制作45-47
• 2.2.3.3 芯片制作47
• 2.2.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)47-48
• 2.2.3.5 腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)及單細(xì)胞懸液制備48-49
• 2.2.3.6 細(xì)胞裂解49-50
• 2.2.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)50
• 2.2.3.8 單細(xì)胞數(shù)字PCR檢測(cè)50-52
• 2.2.3.9 檢測(cè)與分析52
• 2.3 結(jié)果與分析52-59
• 2.3.1 單細(xì)胞微流控芯片的設(shè)計(jì)52-53
• 2.3.2 單細(xì)胞微流控芯片的進(jìn)樣53-55
• 2.3.3 單細(xì)胞數(shù)字PCR55-59
• 2.4 結(jié)論與展望59-61
• 2.5 參考文獻(xiàn)61-64
• 第3章 單細(xì)胞微流控芯片通過(guò)一步法RT-PCR分選與鑒定A549腫瘤干細(xì)胞64-82
• 3.1 引言64-65
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分65-70
• 3.2.1 儀器裝置65-66
• 3.2.2 試劑與儀器66-67
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)操作67-70
• 3.2.3.1 單細(xì)胞微流控芯片的設(shè)計(jì)與制作67
• 3.2.3.2 單細(xì)胞懸液的制備67-69
• 3.2.3.3 單細(xì)胞微流控芯片的進(jìn)樣與操作69-70
• 3.2.3.4 檢測(cè)與分析70
• 3.3 結(jié)果與分析70-77
• 3.3.1 單細(xì)胞微流控芯片的設(shè)計(jì)70-71
• 3.3.2 腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)及單細(xì)胞微流控芯片的進(jìn)樣71-75
• 3.3.2.1 腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)71-72
• 3.3.2.2 腫瘤干細(xì)胞染色72-74
• 3.3.2.3 腫瘤干細(xì)胞大小及單細(xì)胞微流控芯片的進(jìn)樣74-75
• 3.3.3 單細(xì)胞微流控芯片的單細(xì)胞捕獲75
• 3.3.4 單細(xì)胞RT-PCR反應(yīng)結(jié)果75-77
• 3.4 結(jié)論與展望77-79
• 3.5 參考文獻(xiàn)79-82
• 攻讀碩士學(xué)位期間主要的研究成果82-84
• 致謝84

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