本文關(guān)鍵詞：激素難治性前列腺癌耐藥機(jī)制的初步研究

  更多相關(guān)文章： 激素依賴(lài)性前列腺癌 激素難治性前列腺癌 機(jī)制 番茄紅素

【摘要】：前列腺癌是一種最常見(jiàn)的男性惡性腫瘤,其死亡率在男性惡性腫瘤中高居第二位。中國(guó)男性的前列腺癌發(fā)病率雖低于西方一些國(guó)家,但是最近幾年來(lái)由于環(huán)境等因素的變化,使得前列腺癌的發(fā)病率也在不斷增加。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程主要依靠雄激素受體,因此,雄激素去勢(shì)療法成為手術(shù)療法和放射治療之外的第三種標(biāo)準(zhǔn)治療法。但是前列腺癌患者接受18-24個(gè)月的雄激素去勢(shì)治療后,大部分患者對(duì)雄激素去勢(shì)治療不再有效,而轉(zhuǎn)變?yōu)榧に仉y治性前列腺癌(Hormone Refractory Prostate Cancer,HRPC),且容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移,使治療變得更加困難,死亡率也大大增加。因此對(duì)于HRPC轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究成為國(guó)內(nèi)外前列腺癌治療的研究熱點(diǎn)。但是前列腺癌激素耐藥的轉(zhuǎn)化過(guò)程涉及的因素很多,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的大量與前列腺癌產(chǎn)生耐藥性相關(guān)的基因及信號(hào)通路都不能充分說(shuō)明其耐藥機(jī)制,需要進(jìn)一步深入研究。此外,大部分HRPC的研究都以DU145、PC3等激素難治性細(xì)胞為模型,因其不表達(dá)內(nèi)源性雄激素受體不能完全模擬臨床HRPC的轉(zhuǎn)化過(guò)程,因此,得到的信息是非常有限和不完整的,HRPC的形成機(jī)理尚不明確。本研究選擇了具有人前列腺癌功能分化特征的,并有較強(qiáng)的雄激素依賴(lài)性的LNCa P細(xì)胞系,通過(guò)去雄激素的培養(yǎng)環(huán)境誘導(dǎo)建立雄激素抵抗性細(xì)胞模型LNCa P-HR,從而模擬臨床上前列腺癌在接受激素去勢(shì)治療后轉(zhuǎn)變?yōu)榧に仉y治性前列腺癌的過(guò)程,以便用來(lái)探究HRPC轉(zhuǎn)變過(guò)程中的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)機(jī)制。首先,利用基因芯片技術(shù)對(duì)LNCa P和LNCa P-HR細(xì)胞模型進(jìn)行全基因表達(dá)譜的比較分析,結(jié)果得到表達(dá)上調(diào)基因20個(gè),下調(diào)基因206個(gè)。對(duì)差異表達(dá)基因的功能進(jìn)行歸類(lèi)分析,結(jié)果顯示上調(diào)的基因主要涉及細(xì)胞內(nèi)部基因調(diào)控、表達(dá)、代謝、可變剪切等功能,而表達(dá)下調(diào)的基因主要與膜蛋白、跨膜蛋白、離子結(jié)合、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)及基因表達(dá)調(diào)控等功能相關(guān)。結(jié)合生物學(xué)過(guò)程、差異表達(dá)基因的功能及已發(fā)表的文獻(xiàn),分析可能的信號(hào)通路,為探究HRPC的發(fā)生機(jī)制提供方向。根據(jù)基因芯片生物信息學(xué)分析結(jié)果,對(duì)PI3K/AKT途徑、MAPK/ERK、MAPK/P38等信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白進(jìn)行檢測(cè),western blot結(jié)果顯示,與LNCa P相比,LNCa P-HR的AKT下游的NF-κB蛋白表達(dá)升高,但AKT和P-AKT蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著變化,提示NF-κB可能是激素耐藥相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵位點(diǎn),但它的激活不是通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,可能通過(guò)其他的信號(hào)通路激活。MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的western blot結(jié)果顯示,LNCa P-HR與LNCa P相比,ERK、P-ERK蛋白表達(dá)均無(wú)明顯的變化,而P38、P-P38表達(dá)顯著增高,提示MAPK/ERK信號(hào)通路在HRPC轉(zhuǎn)化過(guò)程中沒(méi)有發(fā)揮功能,而MAPK/p38信號(hào)通路在LNCa P轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)NCa P-HR過(guò)程中則可能具有重要作用。以LNCa P和LNCa P-HR細(xì)胞作為激素依賴(lài)和激素難治性前列腺癌模型,對(duì)多種小分子抑制劑和天然產(chǎn)物進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)番茄紅素(Lycopene)作為一種天然的類(lèi)胡蘿卜素,能夠明顯的抑制前列腺癌細(xì)胞尤其是激素難治性細(xì)胞的增殖。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,80μmol/L的番茄紅素能有效抑制LNCa P細(xì)胞增殖,而40μmol/L的番茄紅素就能有效抑制LNCa P-HR細(xì)胞,提示番茄紅素能夠更有效的抑制激素難治性前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。進(jìn)一步探究番茄紅素發(fā)揮此作用的相關(guān)信號(hào)通路,結(jié)果顯示番茄紅素可以上調(diào)LNCa P和LNCa P-HR細(xì)胞P38、P-P38的表達(dá),但對(duì)ERK、AKT、NF-κB的表達(dá)無(wú)明顯作用,提示番茄紅素可能通過(guò)MAPK/p38信號(hào)途徑發(fā)揮抑瘤作用,該現(xiàn)象與前述HRPC轉(zhuǎn)化的可能信號(hào)通路相符合。有研究報(bào)道MAPK/P38信號(hào)通路在卵巢癌、乳腺癌耐藥機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用,但在前列腺癌的耐藥機(jī)制中尚無(wú)報(bào)道。本研究結(jié)果為HRPC機(jī)制的研究及HRPC的治療提供了新的方向。
【關(guān)鍵詞】：激素依賴(lài)性前列腺癌 激素難治性前列腺癌 機(jī)制 番茄紅素
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 中英文對(duì)照詞表13-14
• 第1章 緒論14-21
• 1.1 前列腺癌14-16
• 1.1.1 前列腺癌的分類(lèi)14-15
• 1.1.2 前列腺癌的分級(jí)15-16
• 1.1.3 前列腺癌的診斷及治療16
• 1.2 激素難治性前列腺癌16-17
• 1.3 激素難治性前列腺癌轉(zhuǎn)變機(jī)制17-19
• 1.3.1 雄激素受體信號(hào)通路17-18
• 1.3.2 非雄激素受體信號(hào)途徑18-19
• 1.4 番茄紅素19
• 1.5 立題依據(jù)19-21
• 第2章 材料與試劑21-25
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器21-22
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑22-23
• 2.1.3 細(xì)胞系23
• 2.2 主要試劑配制23-25
• 2.2.1 RPMI1640培養(yǎng)液配制23
• 2.2.2 PBS配制23
• 2.2.3 0.25%胰酶配制23
• 2.2.4 SDS-PAGE電泳緩沖液配制（10×）23-24
• 2.2.5 Western blot轉(zhuǎn)膜液配制（10×）24
• 2.2.6 TBS緩沖液配制（10×）24
• 2.2.7 TBST緩沖液配制24
• 2.2.8 封閉液配制24
• 2.2.9 10%（W/V)SDS溶液配制24
• 2.2.10 10%（W/V)過(guò)硫酸銨（APS）溶液配制24
• 2.2.11 上樣緩沖液24
• 2.2.12 番茄紅素溶液配制24-25
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法25-35
• 3.1 激素難治性前列腺癌細(xì)胞模型的建立25-27
• 3.1.1 前列腺癌LNCaP細(xì)胞的培養(yǎng)25
• 3.1.2 激素難治性前列腺癌LNCaP-HR細(xì)胞的誘導(dǎo)與培養(yǎng)25-26
• 3.1.3 去雄激素與氟他胺共培養(yǎng)的LNCaP-HR+F細(xì)胞的誘導(dǎo)與培養(yǎng)26
• 3.1.4 LNCaP、LNCa P-HR、LNCaP-HR+F細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察26
• 3.1.5 細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)26
• 3.1.6 LNCaP-HR和LNCaP-HR+F細(xì)胞對(duì)氟他胺的抵抗性26-27
• 3.1.7 細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)27
• 3.2 激素難治性前列腺癌基因表達(dá)的檢測(cè)27-29
• 3.2.1 細(xì)胞RNA的提取27-28
• 3.2.2 基因芯片掃描28-29
• 3.2.3 基因芯片中差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)29
• 3.2.4 基因芯片中差異表達(dá)基因的聚類(lèi)分析29
• 3.2.5 基因芯片中差異表達(dá)基因作用通路及潛在耐藥基因分析29
• 3.3 激素難治性前列腺癌相關(guān)通路關(guān)鍵蛋白的檢測(cè)29-31
• 3.3.1 前列腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)29
• 3.3.2 細(xì)胞總蛋白的提取29-30
• 3.3.3 LNCaP和LNCa P-HR細(xì)胞AKT、P-AKT、NF-κB蛋白表達(dá)變化30-31
• 3.3.4 LNCaP和LNCa P-HR細(xì)胞ERK、P-ERK蛋白表達(dá)變化31
• 3.3.5 LNCaP和LNCa P-HR細(xì)胞P38、P-P38蛋白表達(dá)變化31
• 3.4 小分子藥物及天然產(chǎn)物對(duì)激素難治性前列腺癌細(xì)胞的增殖影響31-32
• 3.4.1 細(xì)胞懸液的制備31-32
• 3.4.2 種板32
• 3.4.3 加藥32
• 3.4.4 檢測(cè)32
• 3.5 番茄紅素對(duì)激素難治性前列腺癌細(xì)胞增殖的影響32-33
• 3.5.1 細(xì)胞懸液的制備32-33
• 3.5.2 種板33
• 3.5.3 加藥33
• 3.5.4 檢測(cè)33
• 3.6 番茄紅素對(duì)激素難治性前列腺癌相關(guān)通路關(guān)鍵蛋白的影響33-34
• 3.6.1 前列腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)33
• 3.6.2 番茄紅素作用后LNCa P和LNCa P-HR細(xì)胞總蛋白的提取33-34
• 3.6.3 番茄紅素作用后LNCaP和LNCa P-HR細(xì)胞AKT、P-AKT蛋白表達(dá)變化34
• 3.6.4 番茄紅素作用后LNCaP和LNCa P-HR細(xì)胞ERK蛋白表達(dá)變化34
• 3.6.5 番茄紅素作用后LNCaP和LNCa P-HR細(xì)胞P38蛋白表達(dá)變化34
• 3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析34-35
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-51
• 4.1 激素難治性前列腺癌細(xì)胞模型的建立35-38
• 4.1.1 前列腺癌LNCaP、LNCaP-HR、LNCaP-HR+F細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察35
• 4.1.2 細(xì)胞增殖能力的變化35-36
• 4.1.3 LNCaP-HR和LNCaP-HR+F細(xì)胞對(duì)氟他胺的抵抗性36-37
• 4.1.4 細(xì)胞侵襲能力的變化37-38
• 4.2 激素難治性前列腺癌基因表達(dá)變化38-44
• 4.2.1 激素難治性LNCa P細(xì)胞差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)38-39
• 4.2.2 基因芯片中差異表達(dá)基因的聚類(lèi)分析39
• 4.2.3 基因芯片中差異表達(dá)基因作用通路及潛在耐藥基因分析39-44
• 4.3 激素難治性前列腺癌相關(guān)通路關(guān)鍵蛋白的檢測(cè)44-46
• 4.3.1 LNCaP和LNCa P-HR細(xì)胞AKT、P-AKT、NF-κB蛋白表達(dá)變化44-45
• 4.3.2 LNCaP和LNCa P-HR細(xì)胞ERK、P-ERK蛋白表達(dá)變化45
• 4.3.3 LNCaP和LNCa P-HR細(xì)胞P38、P-P38蛋白表達(dá)變化45-46
• 4.4 小分子藥物及天然產(chǎn)物對(duì)激素難治性前列腺癌細(xì)胞增殖的影響46-48
• 4.5 番茄紅素對(duì)激素難治性前列腺癌細(xì)胞增殖的影響48-49
• 4.6 番茄紅素對(duì)激素難治性前列腺癌相關(guān)通路關(guān)鍵蛋的影響49-51
• 4.6.1 番茄紅素對(duì)LNCa P-HR細(xì)胞AKT、P-AKT蛋白表達(dá)的影響49-50
• 4.6.2 番茄紅素對(duì)LNCa P-HR細(xì)胞ERK蛋白表達(dá)的影響50
• 4.6.3 番茄紅素對(duì)LNCa P-HR細(xì)胞P38蛋白表達(dá)的影響50-51
• 第5章 討論51-54
• 第6章 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 致謝59

【參考文獻(xiàn)】

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