本文關(guān)鍵詞：結(jié)腸腺瘤息肉蛋白N端片段影響纖毛形成和細(xì)胞粘附的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 結(jié)腸腺瘤息肉蛋白 Hedgehog信號通路 AurA HDAC6 纖毛 細(xì)胞粘附 PI3K/AKT信號通路

【摘要】：Adenomatous Polyposis Coli,即結(jié)腸腺瘤息肉蛋白,簡稱APC,參與Wnt信號通路、細(xì)胞遷移、粘附、細(xì)胞極性、染色體正常分離等。纖毛是突出于細(xì)胞表面的一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。纖毛形成受損或結(jié)構(gòu)異常與多種疾病的發(fā)生相關(guān)。細(xì)胞粘附包括細(xì)胞間粘附和細(xì)胞基質(zhì)間粘附,是惡性腫瘤始動轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。已有研究表明APC突變與纖毛形成受損和細(xì)胞粘附異常相關(guān),但具體機(jī)制還不清楚。在多數(shù)APC突變的個體中都保留有其N端1至448個氨基酸的片段(命名為APC-N1),這一片段包括一個寡聚結(jié)構(gòu)域,導(dǎo)致APC同源二聚體結(jié)構(gòu)的形成,從而使蛋白失去活性。本課題主要對APC-N1片段影響纖毛形成和細(xì)胞粘附的機(jī)制進(jìn)行研究,研究內(nèi)容包括以下幾部分：第一部分：首先利用熒光定量PCR和Western印跡方法檢測了MDCK-GFP和MDCK-APC-N1穩(wěn)定細(xì)胞株的Hedgehog信號通路中兩個主要成員Ptchl和Glil的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與對照MDCK-GFP細(xì)胞相比,MDCK-APC-N1細(xì)胞中Ptchl和Glil的表達(dá)上調(diào),表明過表達(dá)APC-N1激活Hedgehog信號通路。分別利用RNA干擾技術(shù)和抑制劑GANT61處理MDCK-APC-N1細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)當(dāng)Glil表達(dá)量降低時,細(xì)胞纖毛形成率顯著升高,表明過表達(dá)APC-N1是通過Hedgehog信號通路影響MDCK細(xì)胞纖毛形成。進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)敲減MDCK-APC-N1細(xì)胞中β-catenin,發(fā)現(xiàn)敲減β-catenin導(dǎo)致Gli1的表達(dá)量降低。以上結(jié)果表明APC-N1通過p-catenin影響Hedgehog信號通路,進(jìn)而抑制纖毛形成。第二部分：利用熒光定量PCR檢測AurA的mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)AurA表達(dá)上調(diào)。分別通過RNA干擾技術(shù)和TSA藥物處理敲減AurA和抑制HDAC6表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)AurA或HDAC6表達(dá)降低時,纖毛形成率明顯增加,表明過表達(dá)APC-N1是通過上調(diào)AurA/HDAC6表達(dá)而抑制纖毛形成。利用RNA干擾技術(shù)敲減Glil檢測AurA和HDAC6表達(dá)變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Glil表達(dá)降低時,AurA和HDAC6表達(dá)量減少。這些結(jié)果表明,過表達(dá)APC-N1通過激活Hedgehog信號通路使AurA/HDAC6表達(dá)量上調(diào),進(jìn)而抑制纖毛形成。第三部分：利用細(xì)胞間粘附實(shí)驗(yàn)、熒光定量PCR、Western印跡檢測APC-N1對細(xì)胞間粘附和相關(guān)粘附分子E-cadherin的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)APC-N1降低細(xì)胞-細(xì)胞間粘附和E-cadherin的表達(dá)。利用結(jié)晶紫染色、熒光定量PCR, Western印跡檢測APC-N1對細(xì)胞基質(zhì)間粘附和相關(guān)粘附分子CD29的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)APC-N1過表達(dá)提高細(xì)胞-基質(zhì)間粘附能力和CD29的表達(dá)。利用RNA干擾技術(shù)敲減β-catenin導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)上調(diào)卻對CD29沒有明顯影響,表明APC-N1通過β-catenin影響E-cadherin的表達(dá)。LY294002藥物處理MDCK-APC-N1細(xì)胞檢測E-cadherin和CD29的表達(dá)情況,結(jié)果顯示P-AKT(T308)蛋白水平減少,E-cadherin表達(dá)量上調(diào),CD29表達(dá)降低。以上結(jié)果表明APC-N1通過PI3K/AKT信號通路影響細(xì)胞粘附。綜上所述,本研究探討了APC-N1影響纖毛形成和細(xì)胞粘附的機(jī)制,結(jié)果表明APC-N1通過β-catenin激活Hedgehog信號通路,進(jìn)而上調(diào)AurA/HDAC6表達(dá),導(dǎo)致纖毛形成受損；此外,APC-N1通過PI3K/AKT信號通路影響細(xì)胞粘附。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸腺瘤息肉蛋白 Hedgehog信號通路 AurA HDAC6 纖毛 細(xì)胞粘附 PI3K/AKT信號通路
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要12-14
• ABSTRACT14-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-29
• 1.1 結(jié)腸腺瘤息肉蛋白16-18
• 1.1.1 結(jié)腸腺瘤息肉蛋白的結(jié)構(gòu)及其氨基酸序列組成16-17
• 1.1.2 結(jié)腸腺瘤息肉蛋白的功能17-18
• 1.1.3 結(jié)腸腺瘤息肉蛋白突變與相關(guān)疾病18
• 1.2 纖毛18-21
• 1.2.1 纖毛的結(jié)構(gòu)及組裝解聚18-19
• 1.2.2 纖毛的功能19-20
• 1.2.3 纖毛與Hedgehog信號通路20-21
• 1.3 結(jié)腸腺瘤息肉蛋白、Hedgehog信號通路和纖毛21-22
• 1.4 細(xì)胞粘附22-23
• 1.4.1 細(xì)胞粘附簡介22-23
• 1.4.2 PI3K/AKT信號通路和細(xì)胞粘附23
• 1.5 結(jié)腸腺瘤息肉蛋白和細(xì)胞粘附23-24
• 1.6 研究目的及意義24
• 參考文獻(xiàn)24-29
• 第二章 APC-N1通過β-catenin激活Hedgehog信號通路進(jìn)而抑制纖毛形成29-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 2.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒29-30
• 2.1.2 抗體及實(shí)驗(yàn)試劑30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 2.2.1 MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)31
• 2.2.2 MDCK細(xì)胞的復(fù)蘇31
• 2.2.3 MDCK細(xì)胞的凍存31-32
• 2.2.4 RNA干擾32
• 2.2.5 抑制劑GANT61藥物處理32
• 2.2.6 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄32-33
• 2.2.7 熒光定量PCR33
• 2.2.8 總蛋白提取33
• 2.2.9 Western印跡33-34
• 2.2.10 免疫熒光染色34
• 2.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析34
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-40
• 2.3.1 APC-N1片段過表達(dá)激活Hedgehog信號通路34-36
• 2.3.2 APC-N1通過Hedgehog信號通路抑制纖毛的生長36-38
• 2.3.3 APC-N1通過β-catenin激活Hedgehog信號通路38-40
• 2.4 討論40
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 第三章 APC-N1通過Hedgehog信號通路調(diào)節(jié)AurA/HDAC6進(jìn)而抑制纖毛生長42-50
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 3.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒42
• 3.1.2 抗體及試劑42-43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法43-44
• 3.2.1 MDCK-APC-N1細(xì)胞的培養(yǎng)43
• 3.2.2 MDCK-APC-N1細(xì)胞的復(fù)蘇43
• 3.2.3 MDCK-APC-N1細(xì)胞的凍存43
• 3.2.4 抑制劑TSA藥物處理43
• 3.2.5 RNA干擾43
• 3.2.6 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄43
• 3.2.7 免疫熒光染色43
• 3.2.8 熒光定量PCR43-44
• 3.2.9 總蛋白提取及Western印跡44
• 3.2.10 統(tǒng)計學(xué)分析44
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-47
• 3.3.1 APC-N1通過上調(diào)AurA和HDAC6影響纖毛形成44-46
• 3.3.2 APC-N1通過Hedgehog信號通路調(diào)節(jié)AurA和HDAC6進(jìn)而抑制纖毛形成46-47
• 3.4 討論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 第四章 APC-N1對犬腎細(xì)胞MDCK細(xì)胞粘附的影響50-61
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 4.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒50
• 4.1.2 抗體及試劑50-51
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法51-52
• 4.2.1 MDCK-APC-GFP、MDCK-APC-N1細(xì)胞的培養(yǎng)、復(fù)蘇、凍存51
• 4.2.2 抑制劑LY294002藥物處理51
• 4.2.3 細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)51
• 4.2.4 細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)51
• 4.2.5 RNA干擾51
• 4.2.6 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄51
• 4.2.7 熒光定量PCR51-52
• 4.2.8 總蛋白提取及Western印跡52
• 4.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析52
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-56
• 4.3.1 APC-N1過表達(dá)對MDCK細(xì)胞間粘附和E-cadherin表達(dá)的影響52-53
• 4.3.2 APC-N1過表達(dá)對MDCK細(xì)胞基質(zhì)間粘附和CD29表達(dá)的影響53-55
• 4.3.3 APC-N1通過β-catenin影響E-cadherin表達(dá)55
• 4.3.4 APC-N1通過PI3K/AKT信號通路影響E-cadherin和CD29的表達(dá)55-56
• 4.4 討論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 結(jié)論與討論61-63
• 附錄1 英文縮略語表63-65
• 附錄2 主要試劑配制65-67
• 附錄3 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備67-68
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果68-69
• 致謝69-70
• 個人簡歷及聯(lián)系方式70-71
• 承諾書71-72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李斌;王濟(jì)明;;組蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)與腫瘤[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2006年12期

2 李文玲;祝文思;牛海波;朱峰;宋莉;李卓玉;;腺瘤性結(jié)腸息肉(APC)蛋白截短突變對MDCK細(xì)胞中細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞間黏附的影響(英文)[J];復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年02期

3 戴文斌;;Wnt通路成員APC、β-catenin、c-myc及黏附分子E-cadherin與大腸癌的關(guān)系[J];中國腫瘤臨床與康復(fù);2007年01期

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本文編號：720826