本文關(guān)鍵詞：重組溶瘤腺病毒對(duì)人腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)、外抑制作用研究

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【摘要】：近年來我國癌癥的發(fā)病率和死亡率逐年攀升,嚴(yán)重威脅著人類健康及生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)僅2015年中國新增癌癥患者人數(shù)約為429.2萬,死亡人數(shù)約為281.4萬。目前臨床上多采用手術(shù)和放化療法治療癌癥,但因上述療法缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性,導(dǎo)致治療過程中正常細(xì)胞也嚴(yán)重受損,因此急需探索腫瘤治療的新方法�；蛑委熓且环N惡性腫瘤的生物療法,但關(guān)鍵問題是如何安全高效地將治療基因遞送至人體內(nèi)。目前腫瘤基因治療中腺病毒載體應(yīng)用最廣泛,溶瘤腺病毒的優(yōu)勢(shì)是僅殺傷腫瘤細(xì)胞但不傷害正常細(xì)胞,因此可作為一種抗腫瘤基因藥物加以應(yīng)用。凋亡素(Apoptin)是雞貧血病毒VP3基因編碼的一種功能蛋白,僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制;血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)是新城疫病毒的一種表面蛋白,能激活細(xì)胞凋亡途徑。因此本研究構(gòu)建表達(dá)Apoptin和HN的重組腺病毒Ad-VT(Ad-Apoptin-hTERTp-E1a)和Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a),研究其是否能成為有效的抗腫瘤基因藥物。本研究分別用Ad-VT感染人骨肉瘤和正常細(xì)胞,以及用Ad-HN-PEG3p-E1a感染人胃癌細(xì)胞。通過MTT法檢測(cè)重組腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的增殖抑制率。體外實(shí)驗(yàn)中,在熒光顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞經(jīng)AO/EB染色、DAPI染色后的形態(tài)學(xué)變化;再利用Annexin V/PI方法通過流式細(xì)胞術(shù)和染色分析重組腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用方式,并通過Caspase酶活性檢測(cè)以上重組腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用途徑。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,采取構(gòu)建動(dòng)物模型并考察腫瘤生長趨勢(shì)和平均生存期。Ad-VT和Ad-HN-PEG3p-E1a能抑制兩種腫瘤細(xì)胞增殖,并伴隨一定的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系,但對(duì)正常細(xì)胞無影響。體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了以上兩種重組腺病毒能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,且是通過激活Caspase相關(guān)酶方式實(shí)現(xiàn)的。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,Ad-VT和Ad-HN-PEG3p-E1a能有效減緩瘤體生長并能延長平均生存期。結(jié)果表明,Ad-VT(Ad-Apoptin-hTERTp-E1a)和Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a)對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性抑制作用,對(duì)于今后腫瘤治療的臨床應(yīng)用具有一定的參考價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：溶瘤腺病毒 凋亡素 病毒載體 癌癥
【學(xué)位授予單位】：長春工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.5
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 英文縮略語8-9
• 第一章 緒論9-19
• 1.1 癌癥與基因治療9-10
• 1.2 基因轉(zhuǎn)移方法10
• 1.3 非病毒載體10-12
• 1.3.1 生物載體10-12
• 1.3.2 非傳統(tǒng)生物載體12
• 1.4 病毒載體12-16
• 1.4.1 腺病毒載體13-14
• 1.4.2 γ 反轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體14-15
• 1.4.3 皰疹病毒15
• 1.4.4 腺相關(guān)病毒15-16
• 1.5 體外細(xì)胞基因治療16-17
• 1.5.1 細(xì)胞的選擇16-17
• 1.5.2 載體的選擇17
• 1.6 基因治療面臨的挑戰(zhàn)17-19
• 1.6.1 安全性問題17-18
• 1.6.2 轉(zhuǎn)基因表達(dá)18
• 1.6.3 從實(shí)驗(yàn)室研究到臨床應(yīng)用18-19
• 第二章 重組腺病毒有效抑制人腫瘤細(xì)胞增殖19-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-20
• 2.1.1 重組腺病毒19
• 2.1.2 細(xì)胞19
• 2.1.3 試劑19-20
• 2.1.4 儀器設(shè)備20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-21
• 2.2.1 復(fù)蘇和傳代HEK-293細(xì)胞20
• 2.2.2 擴(kuò)增重組腺病毒20-21
• 2.2.3 測(cè)定重組腺病毒毒價(jià)21
• 2.2.4 MTT檢測(cè)21
• 2.3 結(jié)果21-29
• 2.3.1 Ad-VT作用時(shí)間對(duì)OS-732細(xì)胞的抑制作用22-23
• 2.3.2 Ad-VT作用時(shí)間對(duì)L02細(xì)胞的抑制作用23-24
• 2.3.3 Ad-VT作用劑量對(duì)OS-732細(xì)胞的抑制作用24-26
• 2.3.4 Ad-VT作用劑量對(duì)L02細(xì)胞的抑制作用26-27
• 2.3.5 Ad-HP對(duì)SGC7901細(xì)胞的抑制作用27-29
• 2.4 討論29-31
• 第三章 重組腺病毒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡31-41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器31-32
• 3.1.1 重組腺病毒31
• 3.1.2 細(xì)胞31
• 3.1.3 試劑31-32
• 3.1.4 儀器設(shè)備32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-33
• 3.2.1 AO/EB染色32
• 3.2.2 DAPI染色32
• 3.2.3 Annexin V檢測(cè)32-33
• 3.2.4 Caspase活性檢測(cè)33
• 3.3 結(jié)果33-39
• 3.3.1 AO/EB染色結(jié)果33-34
• 3.3.2 DAPI染色結(jié)果34-36
• 3.3.3 Annexin V檢測(cè)結(jié)果36-37
• 3.3.4 Caspase活性檢測(cè)結(jié)果37-39
• 3.4 討論39-41
• 第四章 重組腺病毒的體內(nèi)抑瘤作用41-46
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料41-42
• 4.1.1 重組腺病毒41
• 4.1.2 細(xì)胞41
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物41
• 4.1.4 試劑41-42
• 4.1.5 儀器設(shè)備42
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法42-43
• 4.2.1 重組腺病毒的純化42
• 4.2.2 動(dòng)物模型建立42
• 4.2.3 模型分組及治療方案42
• 4.2.4 腫瘤生長趨勢(shì)42-43
• 4.2.5 平均生存期43
• 4.3 結(jié)果43-44
• 4.3.1 腫瘤生長趨勢(shì)43
• 4.3.2 平均生存期43-44
• 4.4 討論44-46
• 第五章 結(jié)論46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 作者簡介54
• 攻讀碩士學(xué)位期間研究成果54

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