本文關(guān)鍵詞：SIRT1在胃癌組織中的表達及其機制研究

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【摘要】：目的：檢測101例胃癌組織中SIRT1、β-catenin的表達水平并探討其與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。通過克隆SIRT1基因的全長cDNA構(gòu)建含有SIRT1及其突變體T200I和E420K基因的重組真核表達載體,從而進一步研究在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中SIRT1及其突變體所發(fā)揮的生物學功能。方法：收集101例濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的胃癌組織,制作石蠟標本,通過免疫組織化學染色檢測SIRT1、β-catenin的表達并分析其與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性。RT-PCR實驗方法擴增SIRT1基因的全長cDNA,其擴增產(chǎn)物通過雙酶切被克隆至pcDNA3.1(+)真核表達載體中,從而使SIRT1基因表達增加。同時采用定點突變的方法構(gòu)建SIRT1基因的突變體T200I和E420K,進而獲得其真核表達載體pcDNA3.1(+)-T200I和pcDNA3.1(+)-E420K。重組質(zhì)粒通過酶切和DNA測序比對得以鑒定,同時采用Western blotting實驗從蛋白水平上證實重組真核表達載體構(gòu)建成功。制備感受態(tài)細胞、做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并通過質(zhì)粒抽提獲取足量的pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-SIRT1、pcDNA3.1(+)-T200I、pcDNA3.1(+)-E420K真核表達載體,然后將其通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到293T細胞中,分別采用MTT、流式細胞術(shù)的方法檢測無DNA轉(zhuǎn)染的空白對照(空白組)、空載體pcDNA3.1(+)(空載組)、重組載體pcDNA3.1(+)- STRT1(WT組)、pcDNA3.1(+)-T200I(T200I組)、pcDNA3.1(+)-E420K (E420K組)五組細胞的增殖及細胞周期改變情況,并且采用Western blot實驗檢測五組細胞中Cyclin D1的表達。SIRT1抑制劑NAM處理293T細胞后檢測其細胞體外增殖能力以及Cyclin D1的表達情況。結(jié)果：胃癌組織中SIRT1、β-catenin基因在的陽性表達率分別為64.4%(65/101)和47.5%(48/101),并且SIRT1在不同胃癌組織學分型中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.05); SIRT1的高表達與胃癌腫瘤大小、發(fā)生部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及β-catenin的表達之間的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),SIRT1表達與β-catenin的表達無相關(guān)性(r=0.01；P=0.751)。通過獲得并擴增SIRT1基因的全長cDNA,構(gòu)建了SIRT1基因的pcDNA3.1(+)-SIRT1重組質(zhì)粒及其突變體基因的pcDNA3.1(+)-T200I和pcDNA3.1(+)-E420K真核表達載體。將其使用酶切以及DNA測序比對測定后證實陽性重組質(zhì)粒與預期序列完全相符。轉(zhuǎn)染293T細胞,MTT實驗顯示重組載體pcDNA3.1(+)-STRT1(WT組)、pcDNA3.1(+)-T200I(T200I組)、pcDNA3.1(+)-E420K (E420K組)的細胞增殖能力高于無DNA轉(zhuǎn)染的空白對照(空白組)和空載體pcDNA3.1(+)(空載組)(P0.05),而WT組、T200I組和E420K組三組之間的細胞增殖能力無顯著差異(P0.05)。SIRT1抑制劑NAM處理293T細胞后其細胞體外增殖能力降低。通過流式細胞術(shù)分析各組細胞的細胞周期,結(jié)果顯示W(wǎng)T組、T200I組和E420K組三組細胞的生長分數(shù)(S期+G2期細胞所占比例)高于空白組和空載組細胞(P0.05),但該三組細胞之間細胞周期改變不顯著(P0.05)。Western blotting實驗也證實了WT組、T200I組和E420K組三組細胞的細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1高表達,而采用SIRT1抑制劑處理后細胞中Cyclin D1低表達。結(jié)論：本研究證實SIRT1在腸型胃癌中的表達明顯高于彌漫性胃癌,由此說明SIRT1在不同組織學類型的胃癌中可能發(fā)揮的作用不同。我們成功構(gòu)建了SIRT1及其突變體基因pcDNA3.1(+)-SIRT1、pcDNA3.1(+)- T200I和pcDNA3.1(+)-E420K的真核表達載體,提供了足夠的SIRT1及其突變體基因的研究材料,有利于進行SIRT1的生物學功能研究。上調(diào)SIRT1及其突變體基因能夠促進促進細胞的體外增殖能力和細胞周期的進展,下調(diào)SIRT1基因的表達抑制細胞的體外增殖能力和細胞周期的進展,其機制可能與改變了CyclinD1的表達相關(guān)。而SIRT1基因的突變體T200I和E420K對細胞增殖和細胞周期沒有影響。本研究顯示SIRT1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中有可能發(fā)揮促癌基因的作用,這提示我們SIRT1的抑制劑有可能具有臨床應用的潛在價值。
【關(guān)鍵詞】：SIRT1 胃癌 Cyclin D1 真核表達載體 重組質(zhì)粒
【學位授予單位】：濱州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 縮略詞表10-12
• 前言12-14
• 第一部分 SIRT1在胃癌組織中的表達及臨床意義14-27
• 1. 材料與方法14-19
• 2. 結(jié)果19-21
• 3. 討論21-24
• 參考文獻24-27
• 第二部分 SIRT1及其突變體T200I、E420K真核表達載體的構(gòu)建及鑒定27-40
• 1. 材料和方法27-33
• 2. 結(jié)果33-35
• 3. 討論35-38
• 參考文獻38-40
• 第三部分 SIRT1基因及其突變體對293T細胞增殖及細胞周期的影響40-56
• 1. 材料與方法40-47
• 2. 結(jié)果47-51
• 3. 討論51-54
• 參考文獻54-56
• 全文總結(jié)56-57
• 文獻綜述 Sirtl與腫瘤耐藥的研究進展57-66
• 參考文獻63-66
• 致謝66-67
• 碩士期間發(fā)表論文情況67

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本文編號：702943