本文關(guān)鍵詞：PIM1激酶線性泛素化修飾及其功能研究

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【摘要】：蛋白激酶PIM是絲/蘇氨酸激酶家族的重要組成部分,包括PIM1、PIM2、PIM3三個(gè)成員,該家族蛋白氨基酸序列同源性很高,功能相近,但其分布具有組織特異性。PIM基因發(fā)揮多方面的生物學(xué)功能,包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝、細(xì)胞自噬、胚胎干細(xì)胞干性維持等多個(gè)方面。目前發(fā)現(xiàn)PIM家族在多種惡性腫瘤中高表達(dá)并在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要功能,已成為抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)。在PIM蛋白家族的三個(gè)成員中,尤以PIM1的功能研究最為廣泛,該分子首次被發(fā)現(xiàn)時(shí)定義為鼠的白血病前病毒插入位點(diǎn),它編碼34 KD和44 KD兩個(gè)亞型的蛋白。PIM1蛋白是一個(gè)刺激反應(yīng)性蛋白,其表達(dá)水平受多種因素誘導(dǎo),例如:GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-5、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、EPO、PMA、干擾素γ等均可誘導(dǎo)其高表達(dá)。PIM1蛋白通過磷酸化不同的底物蛋白從而參與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等多方面功能。在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面,重要的信號(hào)通路Jak-STAT和NF-?B通過促進(jìn)PIM1基因轉(zhuǎn)錄,從而上調(diào)PIM1的表達(dá)水平,另一方面,高表達(dá)的PIM1蛋白又能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)這兩條信號(hào)通路抑制其持續(xù)激活。細(xì)胞周期方面,PIM1可在不同時(shí)期通過磷酸化檢查點(diǎn)蛋白Cdc25A或者Cdc25C影響細(xì)胞周期的進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S或G2/M檢查點(diǎn)的轉(zhuǎn)換;另外PIM1還可通過磷酸化激酶CDK的抑制分子p27Kip1,促進(jìn)p27降解,進(jìn)而加速細(xì)胞周期進(jìn)程。細(xì)胞凋亡方面,PIM1通過磷酸化促凋亡蛋白BAD引發(fā)BAD蛋白的降解,從而抑制細(xì)胞凋亡并提高細(xì)胞存活能力。美國圣地亞哥大學(xué)Mark Sussman等研究證明,PIM1可以通過磷酸化線粒體膜蛋白Drp1從而抑制其線粒體轉(zhuǎn)位,保護(hù)心肌細(xì)胞免受死亡,PIM1已成為缺血性心肌損傷治療的新靶點(diǎn)。泛素化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,它參與調(diào)控細(xì)胞的周期進(jìn)程、基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)方面。已知的泛素化修飾包括單泛素化和多泛素化兩種類型,關(guān)于它們的生物學(xué)功能目前已被廣泛研究。近年來國際上報(bào)導(dǎo)了一種全新的泛素化修飾形式—線性泛素化,它是將泛素以首尾相連的方式共價(jià)結(jié)合到底物蛋白分子的賴氨酸殘基上,完成對底物蛋白的修飾。2009年日本科學(xué)家Kazuhiro Iwai首次報(bào)道NF-?B信號(hào)通路中IKK復(fù)合物的成員NEMO能夠發(fā)生線性泛素化修飾,這種修飾會(huì)改變NEMO自身構(gòu)象,增強(qiáng)IKK復(fù)合體的穩(wěn)定性,進(jìn)而促進(jìn)NF-?B信號(hào)通路的激活。NEMO是已知能夠發(fā)生線性泛素化修飾的蛋白分子,其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是含有一個(gè)親和線性泛素化鏈的UBAN結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域能夠招募線性泛素化鏈,從而使NEMO分子發(fā)生聚合。本項(xiàng)研究以線性泛素化修飾作為切入點(diǎn),希望發(fā)現(xiàn)新的線性泛素化底物分子,并研究其生物學(xué)功能。我們利用UBAN結(jié)構(gòu)域的特殊氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩選到若干潛在的能夠發(fā)生線性泛素化修飾的蛋白分子,其中PIM1蛋白是底物候選分子之一。近年來關(guān)于PIM1功能研究的報(bào)道很多,其發(fā)揮生物學(xué)作用依賴于絲/蘇氨酸激酶活性,科學(xué)家們一直致力于研究激酶PIM1的小分子抑制劑作為抗腫瘤藥物,因此PIM1激酶活性的調(diào)控成為研究重點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道PIM1激酶活性主要受其表達(dá)水平和穩(wěn)定性的調(diào)控,它通常是以泛素—蛋白酶體途徑降解從而影響穩(wěn)定性,那么PIM1蛋白能否通過線性泛素化修飾機(jī)制調(diào)控其激酶活性有待于深入研究。本項(xiàng)研究我們通過泛素化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PIM1蛋白分子能夠發(fā)生線性泛素化修飾,并進(jìn)一步探討了這種特殊翻譯后修飾的生物學(xué)功能。首先我們通過PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增獲得PIM1基因片段,經(jīng)過Hind III和Eco R I兩種限制性核酸內(nèi)切酶酶切得到具有相同酶切位點(diǎn)的PIM1基因片段和pc DNA 3.0載體片段,利用T4 DNA連接酶將PIM1基因片段插入載體中,構(gòu)建表達(dá)良好的Flag-PIM1質(zhì)粒,為后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)奠定良好基礎(chǔ)。在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)線性泛素化E3酶HOIP、HOIL-1L、SHARPIN及Flag-PIM1質(zhì)粒,通過免疫沉淀(IP)方法富集PIM1蛋白,利用線性泛素化抗體免疫印跡發(fā)現(xiàn)過表達(dá)E3酶后,PIM1發(fā)生明顯的線性泛素化修飾現(xiàn)象,而陰性對照組不能觀察到該現(xiàn)象,說明PIM1蛋白在過表達(dá)體系下能夠發(fā)生線性泛素化修飾。為了進(jìn)一步確認(rèn)這一現(xiàn)象并鑒定線性泛素化修飾的賴氨酸殘基位點(diǎn),我們在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)PIM1及線性泛素化E3酶和泛素Ubiquitin,通過IP手段富集線性泛素化修飾的PIM1蛋白分子,經(jīng)過蛋白洗脫,超濾等過程,制備PIM1蛋白樣品并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示PIM1蛋白酶解的肽段中含有氨基酸序列為GGMQIF(G-甘氨酸,M-甲硫氨酸,Q-谷氨酰胺,I-異亮氨酸,F-苯丙氨酸)的多肽片段,此序列為線性泛素化鏈的特征序列,證明了PIM1線性泛素化修飾的存在。此外,質(zhì)譜分析結(jié)果提示K67和K169賴氨酸位點(diǎn)可能作為線性泛素化修飾的位點(diǎn),因此進(jìn)一步研究擬構(gòu)建這兩個(gè)位點(diǎn)的突變體,通過泛素化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證它們是否為線性泛素化修飾位點(diǎn)。PIM1蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的重要生物學(xué)功能依賴于其對眾多底物蛋白的磷酸化修飾,因此我們利用體外激酶實(shí)驗(yàn)研究PIM1線性泛素化修飾是否影響了它的激酶活性。在激酶反應(yīng)體系中,加入純化的組蛋白H3作為PIM1激酶底物、能量ATP、激酶PIM1,以激酶Aurora磷酸化組蛋白H3作為實(shí)驗(yàn)體系的陽性對照。體外激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與未修飾PIM1對照組相比,線性泛素化修飾PIM1導(dǎo)致的組蛋白H3磷酸化水平明顯降低,說明PIM1線性泛素化修飾能夠抑制其激酶活性。綜上,我們發(fā)現(xiàn)了PIM1蛋白一種新的翻譯后修飾方式—線性泛素化修飾,并利用質(zhì)譜方法鑒定了潛在的線性泛素化修飾賴氨酸位點(diǎn),進(jìn)一步體外激酶實(shí)驗(yàn)證明PIM1線性泛素化修飾能夠明顯抑制其絲/蘇氨酸激酶活性。本項(xiàng)研究不僅發(fā)現(xiàn)了PIM1蛋白的線性泛素化修飾現(xiàn)象,而且證明該修飾能夠影響其發(fā)揮功能所需的激酶活性,這將為深入探討PIM1蛋白的生物學(xué)功能提供重要依據(jù),并為基于PIM1抗腫瘤治療研究提供新的思路和策略。
【關(guān)鍵詞】：PIM1 線性泛素化 激酶
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R73-36
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-17
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法17-28
• 1. 材料與來源17-19
• 1.1 菌株與質(zhì)粒17
• 1.2 主要試劑17-18
• 1.2.1 克隆構(gòu)建相關(guān)試劑17
• 1.2.2 免疫印記與免疫沉淀相關(guān)試劑17
• 1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑17-18
• 1.2.4 實(shí)驗(yàn)所需抗體18
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器18-19
• 1.4 主要試劑配方19
• 2.實(shí)驗(yàn)方法19-28
• 2.1 篩選PIM1分子19
• 2.2 Flag-PIM1質(zhì)粒構(gòu)建19-25
• 2.2.1 GFP-PIM1質(zhì)粒測序19-20
• 2.2.2 構(gòu)建Flag-PIM1質(zhì)粒20-24
• 2.2.3 Flag-PIM1陽性克隆鑒定與測序24-25
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染25
• 2.4 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)25-26
• 2.5 質(zhì)譜鑒定26
• 2.6 體外激酶實(shí)驗(yàn)26-27
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理27-28
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-44
• 1. 線性泛素化底物的篩選28
• 2. 構(gòu)建Flag-PIM1質(zhì)粒28-31
• 2.1 Flag-PIM1克隆的構(gòu)建28-30
• 2.2 檢測PIM1基因表達(dá)30-31
• 3. PIM1線性泛素化修飾的鑒定31-36
• 3.1 PIM1與線性泛素化E3酶存在相互作用31
• 3.2 PIM1是線性泛素化底物31-34
• 3.3 PIM1線性泛素化修飾依賴于HOIP的E3酶活性34-35
• 3.4 OTULIN導(dǎo)致PIM1發(fā)生去線性泛素化35-36
• 4. 質(zhì)譜方法鑒定PIM1線性泛素化修飾及位點(diǎn)36-42
• 5. PIM1線性泛素化修飾抑制其激酶活性42-44
• 討論44-46
• 總結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 文獻(xiàn)綜述52-58
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 個(gè)人簡歷58-59
• 致謝59-60

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本文編號(hào)：690347