本文關(guān)鍵詞：組蛋白去甲基化酶RBP2在人胃癌血管生成中的關(guān)鍵作用

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【摘要】：研究目的：在世界范圍內(nèi),胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,在胃癌的癌變過程中,遺傳和表觀遺傳的改變可以導(dǎo)致癌癥的漸進轉(zhuǎn)化。本文研究了組蛋白去甲基化酶RBP2對人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的調(diào)控機制,從而豐富了RBP2參與腫瘤惡性進展和血管生成的機制,確定這一分子機制對胃癌的診斷和治療有一定潛在作用。研究方法：1、在組織水平上,用實時定量PCR和免疫組織化學(xué)的方法檢測了27對(胃癌組織和癌旁正常組織)標(biāo)本中RBP2、VEGF的水平,通過對比RBP2和VEGF在胃癌和癌旁組織中的表達水平,初步確定兩者之間的正相關(guān)性。我們還在這些組織中檢測了表征微血管密度(MVD)的標(biāo)志物CD31和CD34、表征細胞增殖的標(biāo)志物Ki67,進一步分析了RBP2與這幾個分子之間的相關(guān)性。2、在分子水平上,我們利用RBP2的高表達質(zhì)粒和RBP2的小干擾RNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞系,檢測其對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在mRNA水平和蛋白水平表達的影響,同時我們檢測了高表達和干擾RBP2分子對細胞內(nèi)H3K4me2和H3K4me3表達水平的影響。我們又發(fā)現(xiàn)在VEGF的啟動子區(qū)包含有RBP2的調(diào)控下游基因表達的靶序列CCGCCC,我們構(gòu)建了VEGF的啟動子質(zhì)粒和突變質(zhì)粒,通過雙熒光素酶實驗和ChIP實驗證實了RBP2可以通過VEGF啟動子區(qū)序列CCGCCC直接結(jié)合到VEGF的啟動子區(qū)。我們又檢測了高表達和干擾RBP2處理后,胃癌細胞系的克隆形成能力和其條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)微管形成能力的影響。3、在動物水平,我們首先取野生型小鼠、雜合RBP2敲除鼠、純合RBP2敲除鼠的胃部組織,通過實時定量PCR和免疫組化的方法,檢測VEGF的mRNA水平和蛋白水平的變化。然后我們在裸鼠皮下注射RBP2穩(wěn)定干擾的胃癌細胞系BGC-823,實時監(jiān)測腫瘤的形成和體積變化,15天后麻醉處死,分離瘤組織,通過Western Blotting的方法檢測RBP2的敲除效果,利用免疫組化檢測VEGF、CD31、CD34 和 Ki67的表達水平。結(jié)果：1、與正常組織相比,胃癌組織中RBP2和VEGF均高表達,微血管密度(MVD)和細胞增殖也更明顯。2、在胃癌上皮細胞系中高表達RBP2之后,VEGF的mRNA水平和蛋白水平有明顯的升高,干擾RBP2有相反的效果。3、在野生型小鼠、雜合RBP2敲除鼠、純合RBP2敲除鼠的胃部組織中,檢測VEGF的mRNA水平和蛋白水平的變化呈逐步降低的趨勢,CD31、CD34和Ki67也呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,說明敲除RBP2對血管形成和細胞增殖有顯著的抑制作用。4、通過雙熒光素酶實驗和免疫共沉淀實驗(ChIP)證實了RBP2可以通過CCGCCC序列直接結(jié)合到VEGF的啟動子區(qū),進而作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控VEGF的表達水平。5、在胃癌上皮細胞系中,通過克隆形成實驗及回復(fù)實驗,證實RBP2表達顯著促進胃癌細胞的克隆形成能力；通過微管形成實驗證實,高表達RBP2細胞的條件培養(yǎng)基可以顯著誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的微管形成。6、裸鼠皮下注射RBP2穩(wěn)定干擾的BGC-823細胞,通過對瘤體體積的實時監(jiān)測發(fā)現(xiàn),RBP2的敲除可以顯著抑制胃癌細胞的裸鼠皮下成瘤能力；通過對瘤體的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),和對照組相比,RBP2穩(wěn)定干擾組的VEGF、CD31、CD34.Ki67蛋白的表達水平均降低,表明在整體動物水平,RBP2的穩(wěn)定干擾可以降低微血管密度,抑制腫瘤細胞增殖,從而證明RBP2對VEGF的調(diào)控作用。結(jié)論：RBP2可以促進胃癌腫瘤發(fā)生和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達,并促進血管生成。RBP2和活化的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的過度表達可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：RBP2 VEGF 胃癌 血管生成
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 符號說明10-11
• 前言11-13
• 實驗材料13-19
• 實驗方法19-29
• 實驗結(jié)果29-32
• 討論32-35
• 結(jié)論35-36
• 附圖表36-46
• 參考文獻46-51
• 致謝51-52
• 發(fā)表文章情況52-53
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況53

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本文編號：677950