本文關鍵詞：VPA促進冬凌草甲素誘導HL-60細胞凋亡的作用及機制研究

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【摘要】：背景冬凌草甲素(oridonin,ORI)是從傳統(tǒng)中藥冬凌草中提取出來的四環(huán)二萜類天然有機化合物,是冬凌草中發(fā)揮作用的主要成分,具有抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學功能,近年來,研究表明冬凌草甲素能抑制乳腺癌、宮頸癌、肝癌等多種腫瘤細胞的生長,也能抑制急性白血病的惡化,是一種理想的治療急性白血病的藥物。組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)能抑制組蛋白脫乙酰酶,增加組蛋白過乙酰化導致染色體重組、細胞周期停滯、誘導細胞分化和凋亡等一系列生物學作用。研究表明,VPA作為一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑,單獨或者與其他藥物聯(lián)合作用可以通過誘導細胞凋亡發(fā)揮抗白血病的作用。為了增強中藥ORI療效同時降低化療藥物VPA副作用,本研究將小劑量ORI和VPA進行聯(lián)合用藥,觀察他們對急性早幼粒白血病細胞HL-60細胞增殖和凋亡的影響并探討其作用機制,為臨床治療急性早幼粒白血病提供新方案打下實驗基礎。目的探討VPA與冬凌草甲素(oridonin,ORI)聯(lián)合誘導HL-60細胞凋亡的作用及其機制。方法CCK-8法選取ORI和VPA最佳協(xié)同作用劑量;VPA和ORI單獨或聯(lián)合作用于HL-60細胞后光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化以及Hoechst33342染色后熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)學變化;AnnexinV/PI試劑盒檢測HL-60細胞凋亡率;RT-PCR檢測Bax/Bcl-2等凋亡相關基因mRNA水平改變;并通過RT-PCR篩選參與外源性信號通路的死亡受體配體對;Western blot檢測凋亡相關基因caspase-8、caspase-9的蛋白表達和caspase-3剪切片段的表達;預先加入或不加入caspase抑制劑處理HL-60細胞,采用Annexin V/PI流式試劑盒檢測兩藥聯(lián)合后細胞凋亡的變化;Western blot檢測ERK、Pi-ERK,P38、Pi-P38,JNK、Pi-JNK的蛋白表達;分別加入MAPK抑制劑后流式細胞術檢測細胞凋亡率,并通過WB檢測caspase-3的蛋白表達;建立APL動物模型驗證ORI+VPA能否誘導白血病細胞凋亡。結果冬凌草甲素與VPA聯(lián)合治療抑制HL-60細胞增殖;VPA增強冬凌草甲素誘導HL-60細胞凋亡;光學顯微鏡下和Hoechst33342染色后熒光顯微鏡下觀察:ORI+VPA組比單獨用藥組細胞凋亡率多;冬凌草甲素和VPA聯(lián)合作用激活caspase-3、caspase-8和caspase-9;內(nèi)源性凋亡途徑中Bax蛋白表達增高,而Bcl-2蛋白表達降低;外源性凋亡途徑中死亡受體配體對Fas/fasl表達增高;MAPK信號通路中ERK和P38發(fā)生磷酸化,而JNK未發(fā)生磷酸化;APL動物模型中ORI+VPA組實體瘤體積最小,TUNEL結果顯示ORI和VPA能誘導白血病細胞凋亡。結論VPA確實能促進ORI誘導HL-60細胞凋亡,兩者具有協(xié)同作用;VPA+ORI誘導HL-60細胞凋亡具有caspase依賴性;凋亡通過內(nèi)源性和外源性兩條途徑,且死亡受體DR4/DR5和Fas/Fasl均參與介導外源性凋亡途徑;ERK和P38兩條非特異性信號通路參與誘導細胞凋亡;而JNK信號通路基本沒有參與誘導細胞凋亡;建立APL動物模型,由體內(nèi)試驗進一步驗證了體外實驗結果,兩者相符。
【關鍵詞】：VPA 冬凌草甲素 凋亡 白血病 HL-60細胞 MAPK caspase
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71
【目錄】：

• 研究生導師及課題小組成員簡介5-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 主要符號表13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-27
• 1.1 主要材料和儀器16-18
• 1.2 HL-60白血病細胞的傳代與培養(yǎng)18
• 1.3 CCK-8 檢測兩藥聯(lián)合作用18-19
• 1.4 細胞形態(tài)學觀察19
• 1.5 Annexin V/PI流式試劑盒檢測細胞凋亡19-20
• 1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析20-24
• 1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)分析24-26
• 1.8 白血病小鼠動物模型的建立26
• 1.9 統(tǒng)計學處理方法26-27
• 結果27-44
• 2.1 冬凌草甲素與VPA聯(lián)合治療抑制HL-60細胞增殖27-29
• 2.2 VPA增強冬凌草甲素誘導HL-60細胞凋亡29-32
• 2.3 冬凌草甲素和VPA聯(lián)合作用激活caspase-3、caspase-8 和caspase-932-34
• 2.4 內(nèi)源性凋亡通路中關鍵分子的表達34-36
• 2.5 外源性凋亡通路中關鍵分子的表達36-37
• 2.6 MAPK信號通路與ORI和VPA誘導HL-60細胞凋亡的關系37-41
• 2.7 APL動物模型驗證冬凌草甲素和VPA聯(lián)合作用機制41-43
• 2.8 凋亡信號通路相關模式圖43-44
• 討論44-48
• 結論48-49
• 參考文獻49-53
• 綜述53-61
• 參考文獻58-61
• 攻讀碩士學位期間的研究成果61-62
• 致謝62

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