本文關鍵詞：短肽GMBP1通過GRP78逆轉胃癌耐藥的分子機制

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【摘要】：【背景】胃癌發(fā)病率居世界惡性腫瘤第四位,死亡率居第二位,嚴重威脅著人類的健康和生命[1]�；熓沁M展期胃癌治療的主要手段之一,然而多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)現(xiàn)象的產生大大降低了化療效果,目前已知的許多MDR相關分子機制仍不能完全解釋胃癌MDR現(xiàn)象。因此,進一步探索MDR分子機制,尋找新的胃癌耐藥相關分子及信號通路對逆轉胃癌MDR具有重要意義。本課題組利用噬菌體表面展示肽庫技術(phage display techniques),以胃癌耐藥細胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR為陽性細胞,以結合能力為標準,采用生物淘選(biopanning)的方法,并通過藥物敏感實驗進行功能學篩選,獲得了能夠特異結合于胃癌耐藥細胞、逆轉胃癌MDR表型的系列短肽BMBPs(Gastric Multidrug-resistant Binding Peptides,BMBPs)。GMBP1是其中的一種,它能與多種胃癌耐藥細胞特異性結合,具有逆轉胃癌耐藥的活性,并通過蛋白質組學方法進一步篩選并鑒定GMBP1結合受體為GRP78,研究發(fā)現(xiàn)GMBP1與GRP78結合后能夠發(fā)生內化,但GMBP1與GRP78結合是否引起信號通路的活化或抑制,它是如何發(fā)生內化、內化后的亞細胞定位、是否激活新的信號通路,這些機制尚不清楚。因此,本課題擬通過流式細胞技術、si RNA技術及激光共聚焦顯微鏡等方法,研究GMBP1細胞內化的亞細胞定位及其機制;采用蛋白質組學技術及生物信息學方法分析GRP78介導GMBP1逆轉耐藥的關鍵分子。本研究旨在闡明GMBP1逆轉胃癌耐藥的分子機制,有望為胃癌耐藥逆轉治療提供新方法�！灸康摹�1.鑒定GMBP1及其受體GRP78亞細胞定位及GMBP1內化入細胞的機制。2.闡明GMBP1通過GRP78逆轉胃癌耐藥的分子機制,為胃癌耐藥逆轉治療提供實驗依據及可能的候選分子。【方法】1.通過免疫熒光和流式細胞技術分析短肽GMBP1及其受體GRP78在胃癌耐藥細胞的結合靶點亞細胞定位。2.通過si RNA技術建立低表達GRP78的胃癌細胞系(si GRP78-SGC7901/ADR和si GRP78-SGC7901/VCR),利用Western blot和RT-PCR驗證轉染效率。3.通過免疫熒光技術驗證短肽GMBP1進入胃癌耐藥細胞是否是其受體GRP78介導引起的內化。4.選取經典的發(fā)生細胞內化的相關分子轉鐵蛋白,用熒光素標記,通過激光共聚焦分析與FITC-GMBP1共定位情況,揭示其內化途徑。選取針對轉鐵蛋白內化途徑的特異性抑制劑氯丙嗪,通過免疫熒光實驗觀察短肽FITC-GMBP1的內化能否被抑制,進一步證實短肽是通過該途徑發(fā)生的內化。5.采用同位素標記差異蛋白定量分析(i TRAQ)技術,對短肽GMBP1作用胃癌耐藥細胞的差異表達蛋白進行篩選。6.對篩選出來的差異蛋白進行生物信息學分析,即GO分類分析和KEGG信號通路分析,預測差異蛋白所參與的信號通路。7.通過Western blot技術驗證篩選獲得的差異蛋白在GMBP1作用前后耐藥細胞中的表達情況。8.通過Western blot技術檢測短肽GMBP1作用耐藥細胞后差異蛋白、受體GRP78、耐藥和凋亡相關分子的表達情況,初步分析GMBP1及其受體在胃癌多藥耐藥中的作用機制,為胃癌耐藥逆轉治療提供新方法�！窘Y果】1.短肽GMBP1內化入耐藥細胞的機制1)免疫熒光實驗結果證實,GRP78定位于耐藥細胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR胞膜和核周胞漿。2)流式細胞結果顯示,FITC-GMBP1與耐藥細胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR結合后的平均熒光強度高于對照肽FITC-URP,這表明GMBP1與其受體結合后可內化入耐藥細胞。3)Western blot和RT-PCR結果證明,GRP78特異性小干擾RNA轉染后可有效降低胃癌耐藥細胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中GRP78蛋白和m RNA的表達(P0.01)。4)免疫熒光實驗結果顯示,特異性下調GRP78表達后,FITC-GMBP1在耐藥細胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR內的熒光強度較對照組明顯減弱,初步證實短肽GMBP1進入細胞是其受體GRP78介導的內化。5)激光共聚焦實驗結果顯示,FITC-GMBP1(綠色熒光)與Alexa Fluor(AF)-594(紅色熒光)標記的轉鐵蛋白共定位于胞漿內(黃色熒光),氯丙嗪抑制轉鐵蛋白功能后,FITC-GMBP1內化熒光明顯減弱,證實GRP78介導短肽GMBP1內化入耐藥細胞可能是通過轉鐵蛋白途徑發(fā)生的。2.短肽GMBP1作用耐藥細胞后差異表達蛋白的篩選1)對短肽GMBP1作用前后兩個胃癌耐藥細胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR后的蛋白進行i TRAQ篩選,在GMBP1作用后,SGC7901/ADR共鑒定出3752個蛋白,SGC7901/VCR共鑒定出3749個蛋白質。將GMBP1作用后的蛋白表達差異倍數(shù)小于0.8倍,p值小于0.05的蛋白定義為下調蛋白,蛋白表達差異倍數(shù)大于1.5倍,p值小于0.05的蛋白定義為上調蛋白,我們獲得了一組胃癌多藥耐藥相關蛋白。在GMBP1作用SGC7901/ADR細胞系后,發(fā)現(xiàn)共有95個上調蛋白和48個下調蛋白;在GMBP1作用SGC7901/VCR細胞系后,發(fā)現(xiàn)共有129個上調蛋白和88個下調蛋白。其中發(fā)現(xiàn)EIF4E和CTBP2在兩個細胞系共同下調。2)運用生物信息學技術對篩選得到的蛋白進行GO分類分析和KEGG通路分析。GO分析從細胞成分(cellular components,CC)、生物學途徑(biological processes,BP)、分子功能(molecular functions,MF)三方面進行注釋。KEGG分析顯示,短肽GMBP1作用于SGC7901/ADR細胞后差異蛋白參與了38條KEGG通路,短肽GMBP1作用于SGC7901/VCR細胞后差異蛋白參與了79條KEGG通路。我們對這些通路進行富集分析,將前十條顯著富集的KEGG進行整理,結果發(fā)現(xiàn)EIF4E和CTBP2在GMBP1作用于兩個細胞系后均下調,并且發(fā)現(xiàn)CTBP2參與了Wnt信號通路,差異蛋白EIF4E是PI3K/Akt信號通路的下游分子。3.短肽GMBP1作用耐藥細胞后差異表達蛋白的鑒定及其在胃癌耐藥中的作用機制1)Western blot結果顯示,EIF4E和CTBP2在兩個胃癌耐藥細胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR均高表(P0.01),GMBP1作用耐藥細胞后,EIF4E和CTBP2表達均下降,結果與i TRAQ結果一致。2)Western blot結果顯示,GMBP1作用耐藥細胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR后,GRP78、MDR1、Bcl-2的表達水平明顯降低,而Bax的表達增高�！窘Y論】1.短肽GMBP1與其受體GRP78特異性結合后定位于胞漿及胞膜,GMBP1內化入耐藥細胞是其受體GRP78介導、通過經典的轉鐵蛋白途徑發(fā)生的。2.通過i TRAQ技術結合生物信息學分析,完成胃癌多藥耐藥相關蛋白高通量篩選,獲得一組GMBP1作用耐藥細胞后差異表達蛋白分子。其中,GMBP1作用SGC7901/ADR細胞系后,上調蛋白95個,下調蛋白48個;GMBP1作用SGC7901/VCR細胞系后,上調蛋白129個,下調蛋白88個。候選分子EIF4E和CTBP2在多種耐藥細胞中表達變化一致,可能發(fā)揮關鍵作用。3.GMBP1作用耐藥細胞后,EIF4E、MDR1表達明顯降低,Bcl-2/Bax比值下降。因此推測,GMBP1與膜轉位GRP78結合,通過阻斷AKT/PI3K信號通路而下調EIF4E表達,直接或間接降低MDR1的表達和Bcl-2/Bax的比例,從而逆轉胃癌多藥耐藥。其具體機制尚需進一步深入研究。
【關鍵詞】：胃癌 多藥耐藥 GMBP1短肽 葡萄糖調節(jié)蛋白GRP78 iTRAQ
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-18
• 文獻回顧18-41
• 第一部分GMBP1-GRP78復合物內化入耐藥細胞及其機制研究41-59
• 引言41
• 1 材料41-44
• 1.1 細胞株41-42
• 1.2 主要試劑及儀器42-44
• 2 方法44-51
• 2.1 細胞培養(yǎng)44-45
• 2.2 免疫熒光檢測GRP78在耐藥細胞的熒光定位45-46
• 2.3 流式細胞技術檢測FITC-GMBP1與耐藥細胞的結合能力46
• 2.4 細胞轉染46-47
• 2.5 細胞總蛋白樣品制備47
• 2.6 Western blot方法檢測轉染后的細胞中GRP78蛋白質的表達量47-48
• 2.7 RT-PCR方法檢測轉染后的細胞中GRP78 m RNA的表達量48-50
• 2.8 免疫熒光觀察下調GRP78表達后GMBP1內化入耐藥細胞的變化50
• 2.9 激光共聚焦觀察GMBP1內化機制50
• 2.10 干預實驗50-51
• 2.11 統(tǒng)計學處理51
• 3 結果51-57
• 3.1 免疫熒光觀察GRP78在胃癌耐藥細胞的亞細胞定位51-52
• 3.2 流式細胞分析結果52-53
• 3.3 Western blot方法及RT-PCR方法檢測轉染效率53-54
• 3.4 下調GRP78表達后短肽GMBP1內化入耐藥細胞的變化54-55
• 3.5 激光共聚焦技術研究GMBP1內化入細胞的機制55-57
• 4 討論57-59
• 第二部分 基于ITRAQ技術篩選GMBP1作用胃癌耐藥細胞后多藥耐藥相關蛋白59-71
• 引言59-60
• 1 材料60-61
• 1.1 細胞系60
• 1.2 主要試劑和耗材60
• 1.3 主要儀器設備60-61
• 2 方法61-63
• 2.1 細胞培養(yǎng)61
• 2.2 i TRAQ蛋白質提取和定量61-62
• 2.3 丙酮沉淀62
• 2.4 半胱氨酸封閉62
• 2.5 蛋白質酶解62
• 2.6 i TRAQ試劑進行標記62-63
• 2.7 肽段分離和鑒定63
• 2.8 生物信息學分析63
• 3 結果63-68
• 3.1 差異蛋白的蛋白質組學分析63-65
• 3.2 差異蛋白質GO功能聚類分析65-67
• 3.3 差異蛋白質的KEGG信號通路分析67-68
• 4 討論68-71
• 第三部分 初步探討GMBP1及其受體GRP78逆轉胃癌耐藥的分子機制71-79
• 引言71
• 1 材料71-73
• 1.1 細胞株71
• 1.2 主要試劑及儀器71-73
• 2 方法73-74
• 2.1 細胞培養(yǎng)73
• 2.2 Western blot蛋白質提取和定量73
• 2.3 Western blot檢測差異蛋白的表達水平及耐藥和凋亡相關分子表達73-74
• 3 結果74-76
• 3.1 GMBP1作用耐藥細胞后差異蛋白EIF4E和CTBP2表達水平的鑒定74-75
• 3.2 GMBP1作用耐藥細胞后GRP78、MDR1及凋亡相關分子的表達情況 ..· 704 討論75-76
• 4 討論76-79
• 小結79-80
• 參考文獻80-94
• 附錄94-106
• 附錄 194-98
• 附錄 298-104
• 附錄 3104-105
• 附錄 4105-106
• 個人簡歷和研究成果106-108
• 致謝108

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前1條

1 李遠;向姣;張莎莎;劉北忠;龔放;彭明清;;微流控芯片技術分析細胞外酸性環(huán)境對腫瘤細胞P-糖蛋白表達、活性及其介導的道諾霉素細胞毒性的影響[J];中國醫(yī)學科學院學報;2015年01期

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本文編號：630087