本文關(guān)鍵詞：二氫楊梅素對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞體外抗腫瘤作用研究

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【摘要】：目的:肺癌是人類發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,放射治療是其重要的治療手段之一。但是放療帶來的正常組織損傷也很重,放射治療后部分惡性腫瘤細(xì)胞還會出現(xiàn)不同程度的治療抵抗。因此尋找低毒高效的抗腫瘤新藥和放療增敏劑迫在眉睫。二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一個黃酮類化合物,有研究顯示DMY在體內(nèi)外均能發(fā)揮抗腫瘤作用,并且低毒高效,同時還有保護(hù)肝臟、降血脂、抗氧化、提高免疫力等優(yōu)點,另外也有大量研究表明黃酮類化合物存在放療增敏的作用。那么作為黃酮類化合物的DMY很有可能會成為一種低毒高效的抗腫瘤藥物和腫瘤放療增敏劑,為肺癌的治療提供新思路,同時也為我國天然植物藥物在抗癌方面的開發(fā)應(yīng)用提供進(jìn)一步資料。方法:1體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,并穩(wěn)定傳代,取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。2取對數(shù)生長期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,按照5000個每孔的數(shù)量接種于96孔板,孵育24h后,當(dāng)細(xì)胞貼壁良好,約30%-40%密度時,分別換成含不同濃度(0、20、40、60、80、100、140、200μg/ml)DMY的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育,48h后采用MTT比色法檢測不同DMY濃度組A549細(xì)胞的增殖活力,計算得出IC50。3按照5000個每孔的數(shù)目接種細(xì)胞于96孔板,并用不同濃度(0、20、40、60、80、140μg/ml)DMY作用培養(yǎng)48h后,于倒置顯微鏡下檢測和觀察不同濃度DMY對細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)的影響。4按照不同的初始接種密度(1×103、5×103、10×103、50×103、100×103、500×103個每孔)將細(xì)胞分別接種到6孔板中培養(yǎng)24h,當(dāng)細(xì)胞貼壁伸展良好時,并換成含40μg/ml DMY的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育,48h后取出于倒置顯微鏡下觀察相同濃度DMY對不同接種密度細(xì)胞的作用,并拍照記錄。5按照400個/孔的數(shù)量將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng),24h后當(dāng)細(xì)胞貼壁伸展良好時,分別用不同濃度(0、6、7、8、9、10、12、15μg/ml)的DMY作用48h后繼續(xù)培養(yǎng),觀察克隆形成情況,檢測DMY對于A549細(xì)胞的長期抑制作用,并計算得出細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)和IC50。6流式細(xì)胞術(shù)凋亡試劑盒檢測不同濃度(0、20、40、80μg/ml)DMY作用48h后對A549細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。7 Western Blotting檢測不同濃度(0、20、40、80μg/ml)DMY作用A549細(xì)胞48h后凋亡通路Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)。8流式細(xì)胞術(shù)檢測IC20濃度的DMY作用不同時間(6h、12h、24h、48h)對A549細(xì)胞周期時相的改變。9 IC20濃度的DMY預(yù)干預(yù)24h后,分別給予不同劑量(0、2、4、6、8Gy)的照射,并繼續(xù)孵育培養(yǎng),觀察克隆形成情況,檢測DMY對A549細(xì)胞體外放射治療敏感性的影響。10應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)處理軟件SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析,數(shù)據(jù)以x±s表示,根據(jù)資料的目的和類型不同,采用單變量方差分析、單因素方差分析等處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用SNK-q檢驗進(jìn)行方差分析兩兩比較。以P0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果:1 MTT法檢測顯示不同濃度DMY作用48h后對A549細(xì)胞的增殖均出現(xiàn)明顯的抑制作用(P0.05),且隨著藥物濃度的增高抑制作用越明顯,呈劑量依賴關(guān)系。經(jīng)IC50軟件計算得出半數(shù)抑制濃度(IC50)約為64.45μg/ml。2隨著DMY藥物濃度的增加,倒置顯微鏡下可見細(xì)胞的固縮也越明顯,生長能力下降甚至喪失。3相同濃度DMY作用不同接種密度的A549細(xì)胞后,鏡下可見細(xì)胞密度越低,固縮現(xiàn)象越嚴(yán)重,提示DMY的抗腫瘤作用與細(xì)胞密度相關(guān)。4克隆形成實驗結(jié)果顯示,DMY濃度越高抗腫瘤作用越明顯,IC50約在8.46μg/ml處。5流式細(xì)胞術(shù)凋亡實驗顯示DMY濃度越高A549細(xì)胞凋亡率越高。6 Western Blotting檢測結(jié)果顯示高濃度組DMY的Bax蛋白表達(dá)增高,而Bcl-2蛋白表達(dá)降低。7流式細(xì)胞術(shù)周期實驗顯示DMY干預(yù)后24h時A549細(xì)胞的G2/M期比率增高明顯。8克隆形成增敏實驗檢測DMY預(yù)干預(yù)24h后對A549細(xì)胞的放療增敏作用的結(jié)果并未見到顯著增敏作用。結(jié)論:1 DMY對A549細(xì)胞體外存在抗腫瘤作用,并且隨著藥物濃度的增加抗腫瘤作用越明顯。2另外DMY對A549細(xì)胞的抗腫瘤作用與給藥時細(xì)胞的密度有關(guān),細(xì)胞密度越低,DMY對A549細(xì)胞的抗腫瘤作用越強(qiáng),細(xì)胞的生存能力與細(xì)胞密度有關(guān),不同的實驗方法時要注意細(xì)胞初始接種密度對藥物效應(yīng)產(chǎn)生的影響。3 DMY體外對A549細(xì)胞的抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用,與激活了Bax/Bcl-2參與調(diào)控的凋亡通路有關(guān)。4 DMY體外作用24h可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞G2/M期比率顯著增加。5本實驗用DMY預(yù)干預(yù)24h后再照射,目前并未見到明顯增敏作用。討論:DMY體外對A549細(xì)胞抗腫瘤作用是否還存在其他機(jī)制,體內(nèi)是否也存在抗腫瘤作用,DMY體外是否存在放療增敏作用等問題需要進(jìn)一步深入研究。
【關(guān)鍵詞】：二氫楊梅素 肺癌 細(xì)胞增殖 凋亡 細(xì)胞周期 細(xì)胞密度 放療增敏 克隆形成
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-13
• 研究前言13
• 材料和方法13-22
• 結(jié)果22-25
• 附圖25-33
• 附表33-34
• 討論34-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 綜述 放射治療增敏研究進(jìn)展44-50
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 致謝50-51
• 個人簡歷51

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：623074