本文關鍵詞：缺氧誘導胃癌AGS細胞中microRNA-574-3p表達的研究

  更多相關文章： 缺氧 HIF-1α AGS miR-574-3p

【摘要】：研究背景:胃癌是一種很常見的惡性腫瘤,在我國消化道惡性腫瘤發(fā)生率中處于第一位,而死亡率在我國惡性腫瘤中也排名第三位。胃癌死亡率高的原因大多數(shù)是由于早期胃癌不容易被發(fā)現(xiàn),而晚期胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移則是影響其預后的關鍵因素。當腫瘤形成時,腫瘤周圍所處的微環(huán)境是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和預后的一個重要因素。而這種微環(huán)境很容易使胃癌細胞處于一個缺氧的狀態(tài),引發(fā)缺氧誘導因子的表達。缺氧誘導因子在腫瘤細胞中是非常重要的轉(zhuǎn)錄因子,它是許多腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要基因,其中缺氧誘導因子調(diào)控micro RNA(mi RNA)的表達。有關mi RNA的報道有很多,它在腫瘤的整個形成過程,包括生長、轉(zhuǎn)移、浸潤、分化、凋亡等過程中都起著調(diào)控作用。我們今天來探討胃癌AGS細胞在缺氧狀態(tài)下mi R-574-3p表達。材料和方法:本文采用了胃癌細胞系AGS細胞作為研究的基礎,通過用Co Cl2刺激和在缺氧培養(yǎng)箱的培養(yǎng)下來完成本實驗的所有研究。實驗通過不同Co Cl2的濃度來摸索最適濃度,根據(jù)不同氧氣濃度來摸索最適的一種缺氧狀態(tài),分別采用最適濃度Co Cl2(200mM)和最適氧氣(5%O2)來進一步研究。我們采用干擾和激活HIF-1α的表達正反兩方面來研究,采用HIF-1α抑制劑和si-RNA的方法來從反面證實HIF-1α能夠引起mi R-574-3p的上調(diào),我們轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達HIF-1α的質(zhì)粒,通過在常氧下穩(wěn)定表達HIF-1α來看mi R-574-3p的表達情況。我們采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)確定HIF-1α能夠直接作用于mi R-574-3p上游啟動子區(qū)域。我們通過瞬轉(zhuǎn)mi R-574-3p看AGS細胞內(nèi)HIF-1α的表達情況。結果:首先我們利用在環(huán)境中缺氧和氯化鈷模擬缺氧的狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)mi R-574-3p的表達增加,在氯化鈷刺激下,三次的統(tǒng)計結果分析:mi R-574-3p表達量增加了2.18倍;而在缺氧狀態(tài)下,三次的統(tǒng)計結果分析:mi R-574-3p表達量增加了1.93倍;為了進一步證實mi R-574-3p的增加是由HIF-1α引起的,我們采用了抑制劑和si-RNA通過阻斷HIF-1α的表達來證實此問題。三次結果分析:在氯化鈷和缺氧狀態(tài)下抑制劑分別降低約40%和29%,而在氯化鈷和缺氧狀態(tài)下si-RNA分別降低約30%和36%。而且我們還采用了轉(zhuǎn)染HIF-1α的質(zhì)粒,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后mi R-574-3p的表達量增加了2.15倍;我們試用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測后,HIF-1α直接mi R-574-3p上游約1000bp的啟動子區(qū)域結合。我們瞬轉(zhuǎn)mi R-574-3p質(zhì)粒會引起HIF-1α的表達增加1.3倍。結論:研究表明缺氧條件下通過HIF-1α能夠上調(diào)胃癌AGS細胞的mi R-574-3p表達,并且HIF-1α直接作用于mi R-574-3p上游啟動子區(qū)域,mi R-574-3p表達的增加可以上調(diào)HIF-1α的表達量,缺氧上調(diào)mi R-574-3p的表達可能對缺氧激活的HIF/VEGF通路有正反饋調(diào)控作用。
【關鍵詞】：缺氧 HIF-1α AGS miR-574-3p
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 緒論12-20
• 1.1 胃癌及其危害12-13
• 1.2 缺氧誘導因子13-16
• 1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子13
• 1.2.2 缺氧誘導因子13-14
• 1.2.3 缺氧誘導因子的成員及結構14
• 1.2.4 缺氧誘導因子的功能和作用機制14-15
• 1.2.5 缺氧誘導因子的臨床意義15-16
• 1.3 microRNA16-18
• 1.3.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)和命名16
• 1.3.2 miRNA的生物合成16-17
• 1.3.3 miRNA的功能及作用機制17-18
• 1.3.4 miRNA的應用18
• 1.4 腫瘤細胞的分子調(diào)控18-20
• 第2章 HIF-1α與miRNA5743p在胃癌AGS細胞的研究20-44
• 2.1 儀器和材料20-23
• 2.1.1 主要儀器20-21
• 2.1.2 主要試劑和耗材21-23
• 2.1.3 主要試劑配制23
• 2.1.4 細胞株來源23
• 2.2 實驗方法23-32
• 2.2.1 胃癌AGS細胞培養(yǎng)23-24
• 2.2.2 光鏡下觀察AGS細胞的形態(tài)24
• 2.2.3 缺氧培養(yǎng)條件24
• 2.2.4 Western Blot法檢測相關蛋白表達24-28
• 2.2.5 RNA提取28
• 2.2.6 RNA定量28-29
• 2.2.7 DNA&RNA轉(zhuǎn)染29
• 2.2.8 逆轉(zhuǎn)錄反應29-30
• 2.2.9 PCR反應30-31
• 2.2.10 實時定量PCR反應31
• 2.2.11 瓊脂糖凝膠電泳31
• 2.2.12 雙熒光素酶報告系統(tǒng)31
• 2.2.13 質(zhì)粒的提取31-32
• 2.3 數(shù)據(jù)處理32
• 2.4 實驗結果32-44
• 2.4.1 CoCl_2和缺氧環(huán)境下AGS細胞的形態(tài)學變化32-33
• 2.4.2 CoCl_2或缺氧環(huán)境下AGS細胞HIF-1α蛋白的水平33-34
• 2.4.3 CoCl_2刺激上調(diào)AGS細胞中VEGF mRNA的表達34-35
• 2.4.4 CoCl_2或缺氧環(huán)境下AGS細胞中miR5743p的表達35-36
• 2.4.5 HIF-1α的抑制劑能夠抑制miR5743p的表達36-38
• 2.4.6 si-HIF-1α能夠抑制miR5743p的表達38-39
• 2.4.7 pcDNA3-HIF-1α(Mut)質(zhì)粒的酶切驗證39
• 2.4.8 轉(zhuǎn)染pcDNA3-HIF-1α（Mut）質(zhì)粒的蛋白表達39-40
• 2.4.9 轉(zhuǎn)染pcDNA3-HIF-1α（Mut）質(zhì)粒上調(diào)miR5743p的表達40-41
• 2.4.10 雙熒光素酶報告基因的驗證41-42
• 2.4.11 轉(zhuǎn)染pEGFP(C1)-miR574質(zhì)粒檢測其的表達42-43
• 2.4.12 轉(zhuǎn)染pEGFP(C1)-mi R574質(zhì)粒上調(diào)HIF-1α的表達43-44
• 第3章 討論44-46
• 第4章 結論46-47
• 參考文獻47-52
• 在學期間獲得的研究成果52-53
• 致謝53

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Chao Li;Da-Ren Liu;Guo-Gang Li;Hou-Hong Wang;Xiao-Wen Li;Wei Zhang;Yu-Lian Wu;Li Chen;;CD97 promotes gastric cancer cell proliferation and invasion through exosome-mediated MAPK signaling pathway[J];World Journal of Gastroenterology;2015年20期

，

本文編號：610642