發(fā)布時(shí)間：2017-08-01 18:17

  本文關(guān)鍵詞：PNA-TPP靶向抑制線粒體融合增強(qiáng)人肺腺癌干細(xì)胞荷瘤鼠順鉑化療敏感性的研究

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【摘要】：近幾十年來,肺癌的發(fā)病率及死亡率逐年增加,已成為嚴(yán)重威脅人們健康的重要疾病之一。肺癌可分為鱗癌、腺癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌以及大細(xì)胞癌等病理類型,其中,肺腺癌為最常見的病理類型。目前含鉑類聯(lián)合化療是肺癌治療的重要手段,但效果仍非常有限。研究發(fā)現(xiàn),肺癌干細(xì)胞是導(dǎo)致肺癌耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一。線粒體,是一個(gè)形態(tài)結(jié)構(gòu)與分布不斷動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器,線粒體內(nèi)、外膜融合與分裂的精細(xì)調(diào)控,可能在能量代謝、線粒體DNA穩(wěn)定性與完整性、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整的維持性以及侵襲與轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用,此外,近年來研究發(fā)現(xiàn),線粒體融合可保護(hù)腫瘤細(xì)胞以免于凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn),與普通肺癌細(xì)胞相比,肺腺癌干細(xì)胞線粒體具有融合程度增加的現(xiàn)象,其在腫瘤細(xì)胞抗凋亡機(jī)制中有獨(dú)特的作用,這可成為腫瘤治療靶點(diǎn)。抑制肺腺癌干細(xì)胞線粒體融合,提高肺腺癌干細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性,清除肺腺癌干細(xì)胞,對(duì)肺癌治療具有重要臨床意義�；诒菊n題前期研究,肺腺癌干細(xì)胞線粒體融合增強(qiáng),并且增強(qiáng)其耐藥性與抗凋亡特性,本研究旨在構(gòu)建肽核酸-三苯磷復(fù)合物,靶向抑制線粒體融合,增強(qiáng)肺腺癌干細(xì)胞順鉑化療敏感性,進(jìn)而通過構(gòu)建裸鼠荷瘤模型,肽核酸-三苯磷復(fù)合物聯(lián)合順鉑治療荷瘤小鼠,以進(jìn)一步探究肽核酸-三苯磷復(fù)合物臨床應(yīng)用研究。目的:1.觀察肽核酸-三苯磷復(fù)合物(PNA-TPP)干擾肺腺癌干細(xì)胞線粒體能量代謝的生物學(xué)特性,及線粒體融合相關(guān)蛋白的表達(dá);2.構(gòu)建荷瘤模型,探討肽核酸-三苯磷復(fù)合物(PNA-TPP)靶向抑制肺腺癌干細(xì)胞線粒體融合,聯(lián)合順鉑是否可提高荷瘤小鼠的化療敏感性。方法:采用無血清培養(yǎng)基(serum-free medium,SFM)的方法將A549細(xì)胞誘導(dǎo)成具有干性的A549細(xì)胞球;固相肽合成法設(shè)計(jì)合成肽核酸-三苯磷復(fù)合物(PNA-TPP);激光共聚焦顯微鏡觀察PNA-TPP轉(zhuǎn)染后細(xì)胞線粒體的形態(tài)學(xué)變化,檢測(cè)其轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞球及A549細(xì)胞后ATP含量的變化,Western Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后干擾線粒體DNA(mt DNA)能量代謝相關(guān)蛋白(ATP6與ND6)表達(dá)情況,以及線粒體促融合相關(guān)蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A的表達(dá)情況;A549細(xì)胞與具有干性的A549細(xì)胞球分別在NOD-SCID小鼠皮下造模,PNA-TPP聯(lián)合順鉑治療荷瘤小鼠,觀察腫瘤體積變化以及治療效果,檢測(cè)組織中ATP、活性氧(ROS)、胞漿細(xì)胞色素c以及腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況,免疫組化技術(shù)(Immuno histochemistry,IHC)檢測(cè)腫瘤組織促融合蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1、設(shè)計(jì)合成PNA-TPP復(fù)合物高壓液相色譜分析示,14.44 min處可見一單峰,未見明顯雜質(zhì)峰;質(zhì)譜分析示:復(fù)合物分子量為4398.7,符合設(shè)計(jì)要求。2、A549細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基(SFM)誘導(dǎo)成A549細(xì)胞球;PNA-TPP轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞及A549細(xì)胞球后,細(xì)胞ATP含量的明顯下降(P0.05),激光共聚焦觀察線粒體分裂程度增加,PNA-TPP分布與線粒體一致,Western Blot法檢測(cè)線粒體重鏈與輕鏈編碼蛋白ATP6與ND6表達(dá)明顯抑制(P0.05),Western Blot法檢測(cè)線粒體促融合相關(guān)蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A蛋白的表達(dá)均下降(P0.05);3、A549細(xì)胞與A549細(xì)胞球構(gòu)建荷瘤裸鼠模型,與生理鹽水組與順鉑治療組相比,PNA-TPP聯(lián)合順鉑治療荷瘤裸鼠后,腫瘤體積在第四周與第五周統(tǒng)計(jì)具有明顯趨勢(shì)(P0.05),組織ATP含量降低(P0.05),PNA-TPP在腫瘤組織中分布與線粒體一致;免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤組織中線粒體能量代謝相關(guān)蛋白ATP6與ND6、線粒體促融合蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A表達(dá)減少(P0.05);ROS水平增高(P0.05),組織細(xì)胞胞漿色素c增加(P0.05),TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加。結(jié)論:1.A549肺腺癌干細(xì)胞線粒體促融合蛋白表達(dá)較A549細(xì)胞增高,PNA-TPP抑制線粒體能量代謝,抑制線粒體融合蛋白表達(dá)。2.PNA-TPP抑制裸鼠腫瘤組織線粒體融合蛋白表達(dá),聯(lián)合可提高其對(duì)順鉑化療的敏感性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：PNA-TPP 肺腺癌干細(xì)胞 線粒體融合
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料與方法13-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料13-18
• 2.1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物13
• 2.1.2 主要試劑及來源13-14
• 2.1.3 主要儀器和設(shè)備14-15
• 2.1.4 主要試劑配制15-18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-26
• 2.2.1 PNA-TPP干擾肺腺癌干細(xì)胞線粒體融合的研究18-22
• 2.2.2 NOD-SCID荷鼠瘤模型構(gòu)建及PNA-TPP聯(lián)合順鉑治療荷瘤鼠干擾線粒體融合的研究22-26
• 2.3 統(tǒng)計(jì)方法26-27
• 第3章 結(jié)果27-45
• 3.1 PNA-TPP復(fù)合物的鑒定27
• 3.2 A549細(xì)胞與A549細(xì)胞球形態(tài)學(xué)，，LCM觀察PNA-TPP復(fù)合物在A549細(xì)胞球及A549細(xì)胞內(nèi)的空間分布及線粒體形態(tài)學(xué)變化27-29
• 3.2.1 A549細(xì)胞及A549細(xì)胞球形態(tài)學(xué)27-28
• 3.2.2 LCM觀察線粒體形態(tài)學(xué)28-29
• 3.3 PNA-TPP轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞球和A549細(xì)胞后ATP濃度檢測(cè)29-30
• 3.4 Western Blot檢測(cè)PNA-TPP復(fù)合物轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和A549細(xì)胞球后線粒體重鏈與輕鏈蛋白ATP6與ND6表達(dá)30-31
• 3.5 Western Blot檢測(cè)PNA-TPP復(fù)合物轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和A549細(xì)胞球抑制線粒體促融合相關(guān)蛋白MFN1、MFN2、OPA1和ATAD3A的表達(dá)31-32
• 3.6 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)32-33
• 3.7 PNA-TPP在腫瘤組織中分布情況33-34
• 3.8 腫瘤組織ATP濃度檢測(cè)34-35
• 3.9 各組腫瘤組織線粒體重鏈編碼蛋白ATP6與輕鏈編碼蛋白ND6免疫組化結(jié)果35-37
• 3.10 各組腫瘤組織線粒體融合相關(guān)蛋白MFN1、MFN2、OPA1及ATAD3A免疫組化結(jié)果37-42
• 3.11 腫瘤組織胞漿細(xì)胞色素c濃度檢測(cè)42-43
• 3.12 腫瘤組織ROS水平檢測(cè)43-44
• 3.13 各組腫瘤組織細(xì)胞凋亡TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-45
• 第4章 討論45-50
• 第5章 結(jié)論與展望50-51
• 5.1 結(jié)論50
• 5.2 展望50-51
• 致謝51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果56-57
• 綜述57-64
• 參考文獻(xiàn)62-64

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本文編號(hào)：605557