本文關(guān)鍵詞：Snail2和G9a在肝細胞EMT過程中的作用及機制研究

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【摘要】：肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,居惡性腫瘤的第五位。手術(shù)切除和肝臟移植是目前臨床上治療肝癌的主要方法,但是由于肝癌細胞極易侵襲包膜和血管,導致肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移,使得患者的五年生存期仍低于10%。尸檢發(fā)現(xiàn),肝癌患者肝外轉(zhuǎn)移率達到40%-71.6%,是導致患者死亡的主要原因。因此闡明惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移機制對于提高肝癌患者的生存期無疑具有極其重要的意義。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個極其復雜的病理學過程,腫瘤細胞的侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提,而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是惡性腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的關(guān)鍵,因此闡明調(diào)控EMT過程的分子機制已成為腫瘤轉(zhuǎn)移機制研究的關(guān)鍵。上皮細胞表面標志蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達下調(diào)是EMT過程的標志事件,同時伴隨著N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、纖連蛋白(Fibronectin)和波形蛋白(Vimentin)等特定間質(zhì)細胞表面標志蛋白的高表達。特定轉(zhuǎn)錄因子可以通過下調(diào)E-鈣粘蛋白的表達誘導腫瘤細胞的EMT過程,從而促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。Snail是肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中誘導EMT過程的關(guān)鍵作用因子之一,然而,在肝癌細胞的EMT過程中,Snail是通過何種機制抑制E-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)錄的仍不清楚。另外,表觀遺傳學信息的改變也是調(diào)控惡性腫瘤細胞發(fā)生EMT過程的重要機制,各種參與EMT過程的轉(zhuǎn)錄抑制因子可以利用不同的表觀遺傳機制實現(xiàn)對E-鈣粘蛋白的表達調(diào)控。本課題前期研究表明,肝癌的發(fā)生發(fā)展與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a的異常高表達密切相關(guān),同時在乳腺癌細胞中,Snail家族蛋白通過與G9a相互作用共同介導E-鈣粘蛋白的表達抑制,從而促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。然而,Snail和G9a在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用尚未闡明。因此我們推測在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中,Snail通過募集G9a抑制E-鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)錄,從而促進肝癌細胞發(fā)生EMT過程。我們首先利用TGF-β誘導人源肝細胞QSG-7701和HL-7702發(fā)生EMT現(xiàn)象。RT-PCR實驗表明在肝細胞發(fā)生EMT過程中,E-鈣粘蛋白在mRNA表達水平顯著下降,N-鈣粘蛋白、纖連蛋白和波形蛋在mRNA表達水平都明顯增加。同時轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail家族的Snail2在mRNA水平也高表達,而Snail1基因在mRNA水平并未上調(diào)。另外,在33對臨床肝癌組織樣品的檢測中也發(fā)現(xiàn),相比于癌旁組織,Snail2基因在肝癌組織中有高表達的趨勢。接下來,我們進一步驗證Snail2是否通過與G9a蛋白相互作用共同抑制E-鈣粘蛋白的表達。首先分別構(gòu)建了Snail2的全長及N端截短體600bp和C端截短體200bp的質(zhì)粒,以及G9a的全長和N端截短體2039bp和C端截短體1832bp的質(zhì)粒。通過免疫共沉淀實驗證實,Snail2與G9a在體內(nèi)能夠結(jié)合,并且通過截短體的相互作用實驗證明Snail2和G9a的C端有相互作用,與N端并無相互作用,并且Snail2的N端和G9a的C端也沒有結(jié)合,說明二者的作用位點都在C端。同時染色質(zhì)免疫共沉淀實驗也表明,在發(fā)生了EMT過程的肝細胞中,Snail2和G9a均在E-鈣粘蛋白基因上有一定富集,且E-鈣粘蛋白基因上有H3K9me2修飾的發(fā)生,說明Snail2能夠與G9a共同結(jié)合至E-鈣粘蛋白基因上從而抑制其表達。綜上所述,本論文初步確認,Snail2通過與G9a相互作用,將之募集到E-鈣粘蛋白的基因上,使E-鈣粘蛋白基因發(fā)生甲基化修飾,進而導致E-鈣粘蛋白的表達受到抑制,從而誘發(fā)了EMT現(xiàn)象的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：肝細胞 EMT E-鈣黏蛋白 Snail2 G9a
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 肝癌的發(fā)生及其侵襲轉(zhuǎn)移11-13
• 1.1.1 肝癌的發(fā)生11
• 1.1.2 肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移11-13
• 1.2 EMT及其調(diào)控機制13-14
• 1.2.1 EMT與腫瘤13
• 1.2.2 EMT的調(diào)控機制13-14
• 1.3 SNAIL蛋白家族與EMT發(fā)生14-17
• 1.3.1 Snail蛋白14-15
• 1.3.2 Snail蛋白在EMT過程中的作用15-17
• 1.4 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9A與癌癥發(fā)生17-18
• 1.4.1 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a17
• 1.4.2 G9a與癌癥發(fā)生17-18
• 1.5 論文意義與設計18-20
• 1.5.1 論文目的和意義18
• 1.5.2 實驗設計18-20
• 第二章 實驗材料和方法20-36
• 2.1 材料、試劑和儀器20-23
• 2.1.1 實驗材料20-21
• 2.1.2 試劑和溶液21-22
• 2.1.3 主要儀器22-23
• 2.2 實驗方法23-36
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)23
• 2.2.2 EMT現(xiàn)象的誘導方法23
• 2.2.3 細胞總RNA的提取23-24
• 2.2.4 Realtime-PCR實驗24-25
• 2.2.5 質(zhì)粒構(gòu)建25-29
• 2.2.5.1 Snail2的真核表達質(zhì)粒構(gòu)建25-27
• 2.2.5.2 G9a的真核表達質(zhì)粒構(gòu)建27-29
• 2.2.6 細胞轉(zhuǎn)染29-30
• 2.2.7 樣品制備30
• 2.2.8 Western blot及SDS- PAGE30-32
• 2.2.9 免疫共沉淀（Co-IP）32
• 2.2.10 染色質(zhì)免疫共沉淀（Ch IP）實驗32-36
• 第三章 實驗結(jié)果36-50
• 3.1 人肝細胞發(fā)生EMT過程的細胞形態(tài)學變化36-39
• 3.2 肝細胞EMT過程中相關(guān)基因的表達水平變化39-40
• 3.3 SNAIL2基因在臨床肝癌組織和癌旁組織中的表達差異40-41
• 3.4 SNAIL2和G9A相互作用41-48
• 3.4.1 Snail2全長，N端和C端質(zhì)粒的構(gòu)建42-44
• 3.4.1.1 Snail2全長的構(gòu)建42-43
• 3.4.1.2 Snail2 N端和C端的構(gòu)建43-44
• 3.4.2 G9a的N端和C端質(zhì)粒的構(gòu)建44-45
• 3.4.3 Snail2與G9a的試表達45-46
• 3.4.4 Snail2與G9a的相互作用46-48
• 3.5 Snail2和G9a在肝細胞發(fā)生EMT過程中的作用機制48-50
• 第四章 結(jié)論與討論50-52
• 參考文獻52-57
• 作者簡介57-58
• 致謝58

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