本文關鍵詞：米非司酮對人腦膠質瘤U251細胞活性的作用及機理的研究

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【摘要】：目的米非司酮(Mifepristone,RU486)是由人工合成的一種19-去甲類固醇激素,能夠有效的和孕酮受體、糖皮質激素受體結合,并對上述激素有很強的拮抗作用,是臨床上一種常見的甾體類抗孕激素藥物。近期研究發(fā)現(xiàn),米非司酮對腫瘤的生長有較好的抑制作用,而其對孕酮和糖皮質激素拮抗效應也受到了廣泛關注。然而,米非司酮對腫瘤的作用機制仍存在很大的爭論。正常體內(nèi)孕酮激素和糖皮質激素合成在線粒體完成,原料為膽固醇,通過線粒體膜表面的18 kDa轉位分子蛋白(18 kDa translocator protein,TSPO),轉運至線粒體內(nèi),合成孕酮和糖皮質激素。此過程中,TSPO的數(shù)量和活性對于孕酮和糖皮質激素合成起到至關重要的作用,反過來,體內(nèi)孕酮和糖皮質激素濃度對TSPO也存在負反饋作用,即孕酮和糖皮質激素濃度高,負反饋調(diào)節(jié)TSPO表達下降,活性降低,從而減少膽固醇運輸,減少孕酮和糖皮質激素合成,反之亦然。TSPO是線粒體凋亡途徑(Mitochondrial apoptosis pathway)中關鍵調(diào)節(jié)蛋白,激活后可通過啟動細胞凋亡,在腫瘤生長過程中發(fā)揮抑制作用。因此,本研究的假說為:米非司酮通過抑制孕酮和糖皮質激素活性,減少孕酮和糖皮質激素對TSPO負反饋作用,增加TSPO表達及活性,通過線粒體凋亡途徑,增加細胞凋亡,抑制腫瘤生長。本實驗通過米非司酮對人腦膠質瘤細胞系U251體外實驗研究,探討米非司酮是否對U251細胞株具有抑制細胞增殖活性作用,并觀察米非司酮對U251細胞凋亡的影響和TSPO、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的變化,初步探討米非司酮誘導U251細胞凋亡的相關作用機制,為新型抗腫瘤藥物研發(fā)提供基礎實驗依據(jù)。方法第一部分使用CCK-8微板比色法檢測不同濃度的米非司酮(2.5、5、10、20、40μmol/L)組中U251細胞活性,臺盼蘭染色法檢測細胞死亡率。第二部分根據(jù)第一部分的實驗結果,選取米非司酮5、10、20 umol/L三個濃度組,通過Hoechst33258染色、流式細胞儀檢測U251細胞凋亡,采用蛋白印跡法和免疫熒光染色法檢測U251細胞中TSPO,Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相關蛋白表達。結果第一部分細胞活性檢測結果顯示:與對照組比較,5、10、20、40(μmol/L)米非司酮組細胞存活率明顯降低,且與藥物濃度成正比,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。低濃度米非司酮(2.5μmol/L)組對細胞存活率影響不明顯,與對照組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05)。死亡細胞檢測結果顯示:米非司酮組U251細胞死亡率較對照組均有所增加,且與藥物濃度成正比。但當米非司酮濃度增加至20、40μmol/L時,各組間抑制作用已無明顯差異。第二部分細胞凋亡檢測顯示,與對照組相比,米非司酮組細胞凋亡率增加明顯,且一定范圍內(nèi)與藥物濃度成正比,其中10μmol/L米非司酮濃度組TSPO的表達增加最明顯(P0.05)。凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3在米非司酮各濃度組中均有表達,其中20μmol/L濃度組Bcl-2蛋白表達明顯低于對照組(P0.05),而Bax、Caspase-3蛋白表達在20μmol/L濃度組中明顯高于對照組(P0.05)。結論(1)米非司酮在適當濃度范圍內(nèi)對膠質瘤U251細胞有增殖抑制作用,促進細胞凋亡的作用;(2)米非司酮對膠質瘤U251細胞有促凋亡作用,其機制可能與促進TSPO表達,啟動線粒體凋亡途徑有關。
【關鍵詞】：膠質瘤 米非司酮 18kDa轉運蛋白 線粒體凋亡
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 中英文縮寫對照詞表6-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 引言12-18
• 參考文獻14-18
• 第一部分 米非司酮對膠質瘤U251細胞增殖的影響18-28
• 1 材料19-21
• 1.1 實驗細胞19-20
• 1.2 主要試劑20
• 1.3 主要儀器20-21
• 1.4 主要試劑配制21
• 2 方法21-23
• 2.1 細胞培養(yǎng)21-22
• 2.2 CCK-8 微板比色法檢測細胞活性22-23
• 2.3 臺盼蘭染色法檢測細胞死亡率23
• 2.4 統(tǒng)計學分析23
• 3 結果23-25
• 3.1 細胞活性檢測結果23-24
• 3.2 死亡細胞檢測結果24-25
• 4 討論25-26
• 參考文獻26-28
• 第二部分 米非司酮誘導膠質瘤U251細胞凋亡及機理28-46
• 1 材料29-31
• 1.1 實驗細胞29
• 1.2 主要試劑29-30
• 1.3 主要儀器30-31
• 1.4 主要試劑配制31
• 2 方法31-35
• 2.1 細胞培養(yǎng)31
• 2.2 Hoechst33258染色法觀察細胞核染色形態(tài)31-32
• 2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡(Annexin V-FITC/PI雙標法)32
• 2.4 免疫細胞化學染色法及免疫印跡法檢測TSPO蛋白表達32-34
• 2.5 免疫印跡法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達34-35
• 2.6 統(tǒng)計學分析35
• 3 結果35-42
• 3.1 凋亡細胞核形態(tài)檢測結果35
• 3.2 細胞凋亡率檢測結果35-37
• 3.3 細胞TSPO蛋白表達檢測結果37-39
• 3.4 Bcl-2、Bax、Caspase-3 凋亡相關蛋白表達檢測結果39-42
• 4 討論42-43
• 參考文獻43-46
• 綜述46-64
• 參考文獻55-64
• 致謝64-65
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文65

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本文編號：582312