本文關鍵詞：miR-320靶向FOXM1調控結腸癌化放療敏感性的機制研究

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【摘要】：目的:探討mi R-320對人結腸癌細胞生物學行為、5-FU和奧沙利鉑化療耐藥及放射線抵抗的影響,并初步闡明mi R-320逆轉人結腸癌細胞耐藥及放療抵抗的機制。方法:1.選擇mi R-320相對低表達的HCT116結腸癌細胞及mi R-320相對高表達的HT-29細胞,分別轉染mi R-320 mimics及mi R-320 inhibitor,并各自轉染無義序列NC為對照組。采用實時定量PCR方法檢測結腸癌細胞mi R-320表達變化。2.采用MTT法、克隆形成試驗檢測轉染后四組結腸癌細胞(HCT116-mimics、HCT116-NC、HT-29-inhibitor、HT-29-NC)的增殖能力;采用流式細胞術檢測四組結腸癌細胞凋亡和細胞周期;采用Transwell實驗檢測四組結腸癌細胞遷移及侵襲能力。MTT法檢測5-FU和奧沙利鉑對四組細胞的抑制率并計算IC50值。MTT法檢測經放射線處理后的細胞活性。3.采用雙熒光素酶報告基因試驗驗證mi R-320是否可與FOXM1 3’UTR靶向結合。RT-PCR技術檢測mi R-320對FOXM1 m RNA表達水平的影響。Western blot技術檢測mi R-320對FOXM1、β-catenin、Cyclin D1、c-myc蛋白表達水平的影響。結果:1.RT-PCR結果顯示,轉染后mi R-320表達水平在HCT116-mimics組細胞較HCT116-NC組細胞明顯升高;HT-29-inhibitor組則較HT-29-NC組明顯下降。2.上調mi R-320明顯抑制HCT116結腸癌細胞增殖及克隆形成能力,抑制細胞周期進展,抑制細胞遷移及侵襲,并增強細胞對5-FU、奧沙利鉑及放射線的敏感性,但不影響細胞凋亡率;下調mi R-320則增強HT-29結腸癌細胞增殖及克隆形成能力,促進細胞周期進展,增強細胞遷移及侵襲能力,并降低細胞對5-FU、奧沙利鉑及放射線的敏感性,但不影響細胞凋亡率。3.雙熒光素酶報告基因試驗中,共轉染mi R-320 mimics后熒光素酶活性明顯降低,而FOXM1 3’UTR突變組中熒光素酶活性則無明顯變化,表明mi R-320可靶向結合于FOXM1 3’UTR區(qū)。RT-PCR結果顯示,轉染后FOXM1 m RNA水平的改變無統(tǒng)計學意義。Western blot結果顯示,上調mi R-320后,FOXM1、β-catenin、Cyclin D1、c-myc蛋白水平明顯下降;相反,下調mi R-320后,上述蛋白表達量均明顯升高。結論:1.mi R-320可抑制結腸癌細胞增殖、細胞周期進展、細胞遷移及侵襲能力,并增強結腸癌細胞對5-FU、奧沙利鉑及放射線的敏感性。2.結腸癌細胞中mi R-320可靶向抑制FOXM1表達,這在mi R-320對5-FU、奧沙利鉑及放射線敏感性的調控中可能具有重要作用。
【關鍵詞】：miR-320 結腸癌 FOXM1 化療抵抗 Wnt
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文縮略詞表9-10
• 第1章 引言10-14
• 第2章 材料與方法14-31
• 2.1 實驗材料14-16
• 2.1.1 實驗細胞和培養(yǎng)方法14
• 2.1.2 實驗試劑14-16
• 2.2 主要實驗設備16-17
• 2.3 實驗方法17-30
• 2.3.1 HCT116 和HT-29 結腸癌細胞株的培養(yǎng)17-18
• 2.3.2 miR-320 mimics和miR-320 inhibitor轉染結腸癌細胞18
• 2.3.3 熒光顯微鏡觀察結腸癌細胞轉染效率18
• 2.3.4 real-time PCR檢測結腸癌細胞miR-320 表達18-20
• 2.3.5 MTT法檢測細胞增值20
• 2.3.6 平板克隆形成試驗20-21
• 2.3.7 流式細胞儀檢測細胞周期21
• 2.3.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡21
• 2.3.9 Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲能力21-22
• 2.3.10 MTT法檢測結腸癌化療敏感性22-23
• 2.3.11 MTT法檢測結腸癌放療敏感性23
• 2.3.12 生物信息學預測miR-320 靶基因23-25
• 2.3.13 雙熒光素酶報告基因試驗25-28
• 2.3.14 實時定量PCR檢測轉染后結腸癌細胞基因m RNA表達量28
• 2.3.15 Western blot檢測轉染后結腸癌細胞基因蛋白表達量28-30
• 2.4 統(tǒng)計學處理30-31
• 第3章 結果31-42
• 3.1 熒光顯微鏡觀察結腸癌細胞轉染效率31
• 3.2 實時定量PCR驗證轉染效率31-32
• 3.3 miR-320 對結腸癌細胞增殖的影響32-33
• 3.3.1 MTT法檢測細胞生長曲線32-33
• 3.3.2 克隆形成試驗33
• 3.4. miR-320 對結腸癌細胞周期及細胞凋亡的影響33-35
• 3.4.1 PI單染法檢測細胞周期33-34
• 3.4.2 Annexin V-FITC /PI雙染法檢測細胞凋亡34-35
• 3.5. miR-320 對結腸癌細胞遷移、侵襲能力的影響35-36
• 3.6. miR-320 增加結腸癌細胞對 5-FU及奧沙利鉑的敏感性36-38
• 3.7.miR-320 增加結腸癌細胞對放療的敏感性38
• 3.8.雙熒光素酶報告系統(tǒng)的建立及FOXM1 為miR-320 靶基因的驗證38-42
• 3.8.1 FOXM13’UTR雙熒光素酶報告基因建立38-39
• 3.8.2 熒光素酶活性檢測驗證FOXM1 為miR-320 靶基因39-40
• 3.8.3 實時定量PCR檢測HCT116 及HT-29 細胞中FOXM1 表達情況3040
• 3.8.4 Western blot檢測HCT116 及HT-29 細胞中FOXM1 及Wnt通路蛋白表達情況40-42
• 第4章 討論42-47
• 第5章 結論及展望47-48
• 致謝48-49
• 參考文獻49-53
• 攻讀學位期間的研究成果53-54
• 綜述54-62
• 參考文獻60-62
• 附件62

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前2條

1 Jian Yao;Lin-hui Liang;Yu Zhang;Jie Ding;Qi Tian;Jin-jun Li;Xiang-huo He;;GNAI1 Suppresses Tumor Cell Migration and Invasion and is Post-Transcriptionally Regulated by Mir-320a/c/d in Hepatocellular Carcinoma[J];Cancer Biology & Medicine;2012年04期

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本文編號：570041