本文關(guān)鍵詞：基于信號放大技術(shù)在腫瘤細胞及其標志物中的研究

  更多相關(guān)文章： DNA循環(huán)放大 溶菌酶 microRNA 四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針 三螺旋結(jié)構(gòu)分子探針

【摘要】：本文采用表面增強拉曼散射分析方法和熒光分析方法,設(shè)計納米金生物條碼用于SERS活性檢測,構(gòu)建了基于靶循環(huán)放大方法和聚合剪切引發(fā)的循環(huán)放大方法、基于三螺旋分子探針和滾環(huán)復(fù)制的循環(huán)放大方法、基于靶引發(fā)的發(fā)卡DNA循環(huán)放大方法,實現(xiàn)了對溶菌酶、mi RNA等腫瘤標志物的高靈敏、高特異性檢測。主要內(nèi)容包含以下幾個方面:1.利用簡單方法制備了一種新型的DNA四螺旋結(jié)構(gòu)分子(FHJM)探針,它包含三個功能部分:適體-目標物識別區(qū)域,引發(fā)循環(huán)放大反應(yīng)的觸發(fā)區(qū)域,聚合-剪切放大反應(yīng)的模板區(qū)域。四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針中的引發(fā)鏈DNA-1被設(shè)計成含有溶菌酶適配子的一段序列,用于靶的識別,并構(gòu)成了四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針左側(cè)兩邊手臂中的一支。用于聚合剪切的模板鏈DNA-2通過瓦特生-克里克堿基互補配對構(gòu)成了四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針中的右邊部分。它右側(cè)的兩個分支通過單鏈DNA-b連接從而構(gòu)成了四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針右側(cè)的環(huán)形部分,基于交叉堿基配對原理,觸發(fā)鏈DNA-b構(gòu)成了我們分支探針的四螺旋序列。當存在溶菌酶時,它可以與DNA-6鏈雜交。我們首次將這種探針引入到表面增強拉曼散射(SERS)檢測技術(shù)中,成功發(fā)展了一種FHJM-SERS檢測方法,實現(xiàn)了對溶菌酶的高靈敏度檢測,檢測限可以低至0.5 fM。結(jié)合了適體識別技術(shù),FHJM-SERS的檢測方法具有很好的特異性,如果把各種識別單元植入到這種FHJM探針中,將可能構(gòu)建一種能夠識別各種目標物的傳感平臺。另外,該方法為我們提供了一個高靈敏性的平臺,這極大的拓展了我們的研究視野。2.基于核酸分子聚集體(NAMAs)在氧化石墨烯納米片(graphene oxide,簡稱GO)上自組裝和由靶識別區(qū)域及引發(fā)滾環(huán)放大反應(yīng)的引物區(qū)域構(gòu)成的三螺旋結(jié)構(gòu),我們研發(fā)了一種新型的,高靈敏的方法來檢測miRNA和進行細胞內(nèi)成像分析,這是首次將滾環(huán)放大反應(yīng)引入細胞內(nèi)進行。修飾有FAM熒光基團的單鏈DNA能夠被氧化石墨烯納米片猝滅,但當遠離時,又會重新恢復(fù)熒光。值得注意的是,核酸分子自組裝策略被成功的應(yīng)用于低豐度靶miRNA的檢測和細胞內(nèi)成像分析。與傳統(tǒng)的滾環(huán)放大反應(yīng)比較,自組裝的核酸分子聚集體能在細胞內(nèi)聚集并在單個的癌細胞內(nèi)產(chǎn)生明亮的熒光斑點,因此可以顯著的區(qū)別癌細胞和正常細胞�；诤怂岱肿泳奂w的細胞內(nèi)靶miRNA成像技術(shù)對早期癌癥檢測起到了極大的促進作用,成為一種新型有效的可視化細胞檢測技術(shù)。3.通過對介孔二氧化硅納米粒子的氨基化修飾(PCMSNs),使其表面呈正電,利用正負電相互吸引,使得核酸分子聚集體在其表面發(fā)生自組裝之后進入細胞,在此原理的基礎(chǔ)上,首次設(shè)計了基于氨基修飾的介孔二氧化硅納米粒子核酸分子聚集體(ONAAs)自組裝,引發(fā)單細胞內(nèi)雜交鏈式反應(yīng)(HCR),實現(xiàn)對靶microRNA的檢測。由此,我們構(gòu)建了一種新型的ONAAs-PCMSNs策略用于單細胞內(nèi)靶miRNAs的分析。整個策略的設(shè)計關(guān)鍵是核酸分子通過靜電作用發(fā)生自組裝,能夠引發(fā)雜交鏈式反應(yīng),進而實現(xiàn)信號分子的聚集與放大。我們設(shè)計了兩種發(fā)卡結(jié)構(gòu)的探針DNA-N1和DNA-N2,其中DNA-N2分別修飾熒光分子ROX和猝滅分子BHQ。發(fā)卡探針DNA-N1和DNA-N2的環(huán)部區(qū)域可以靈活的在表面帶有正電荷的PCMSNs上發(fā)生自組裝;當探針N1和N2在PCMSNs表面自組裝后,導(dǎo)入活細胞內(nèi)進行孵育,在靶的誘導(dǎo)作用下使其表面的N1發(fā)生游離或者流動性增加。然后,大量的發(fā)卡N2鏈的莖部被打開。在該方法中,鏈式反應(yīng)通過N1和N2的交替雜交而引發(fā),形成N1和N2的聚集體。由于靜電吸引作用,雜交鏈式反應(yīng)產(chǎn)物在PCMSNs表面發(fā)生自組裝,形成具有穩(wěn)定的構(gòu)象的核酸分子聚集體,進而產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號的變化。和之前的氧化石墨烯納米片作載體檢測細胞內(nèi)靶相比,放大效率顯著提高。
【關(guān)鍵詞】：DNA循環(huán)放大 溶菌酶 microRNA 四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針 三螺旋結(jié)構(gòu)分子探針
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.43
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 第一章 前言14-32
• 1.1 MicroRNA簡介15-16
• 1.1.1 MicroRNA概念及特點15
• 1.1.2 MicroRNA的發(fā)現(xiàn)過程15-16
• 1.2 MicroRNA與疾病16-17
• 1.2.1 腫瘤16
• 1.2.2 腫瘤標志物16
• 1.2.3 MicroRNA與癌癥16-17
• 1.3 MicroRNA及端粒酶的檢測17-18
• 1.3.1 Northern Blot及其改進17-18
• 1.3.2 Microarray及微球高通量檢測法簡介18
• 1.4 納米材料18-20
• 1.4.1 基于納米金技術(shù)的檢測18-19
• 1.4.2 基于介孔二氧化硅的檢測19
• 1.4.3 基于石墨烯的檢測19-20
• 1.5 DNA循環(huán)放大技術(shù)20-21
• 1.5.1 滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng)20-21
• 1.5.2 雜交鏈式反應(yīng)21
• 1.6 表面增強拉曼散射21-23
• 1.6.1 拉曼散射21-22
• 1.6.2 表面增強拉曼散射技術(shù)22-23
• 1.6.2.1 SERS簡介22
• 1.6.2.2 SERS在生物分析中的應(yīng)用22-23
• 1.7 本工作的研究意義及內(nèi)容23-24
• 參考文獻24-32
• 第二章 基于四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針的循環(huán)放大體系用于溶菌酶的SERS高靈敏檢測32-50
• 2.1 實驗部分33-38
• 2.1.1 試劑33-35
• 2.1.2 儀器35
• 2.1.3 納米金的合成35
• 2.1.4 DNA-3 及發(fā)卡DNA在磁珠上的固定35-36
• 2.1.5 表面增強拉曼信號探針的構(gòu)建36
• 2.1.6 四螺旋結(jié)構(gòu)分子探針-表面增強拉曼反應(yīng)原理36-37
• 2.1.7 表面增強拉曼檢測37-38
• 2.2 結(jié)果與討論38-46
• 2.2.1 納米金的電鏡(Transmission Electron Microscope, 簡稱TEM)表征38
• 2.2.2 納米金巰基復(fù)合物的紫外表征38-39
• 2.2.3 FHJM的構(gòu)建及凝膠電泳成像39-40
• 2.2.4 方案的可行性驗證40-41
• 2.2.5 對照實驗41
• 2.2.6 對溶菌酶的定量實驗41-43
• 2.2.7 特異性實驗43-44
• 2.2.8 實驗條件的優(yōu)化44-46
• 2.2.8.1 溫度和pH對反應(yīng)的影響44-45
• 2.2.8.2 KF聚合酶和核酸內(nèi)切酶量的影響45-46
• 2.2.8.3 孵育時間的優(yōu)化46
• 2.3 實驗小結(jié)46-47
• 參考文獻47-50
• 第三章 基于三螺旋結(jié)構(gòu)探針和自組裝核酸分子聚集體的活細胞內(nèi)miRNA的可視化檢測50-69
• 3.1 實驗部分51-55
• 3.1.1 材料與試劑51-53
• 3.1.2 儀器53
• 3.1.3 三螺旋結(jié)構(gòu)分子及環(huán)鏈DNA在納米磁珠表面的固定53-54
• 3.1.4 羧基修飾納米磁珠的制備54
• 3.1.5 氧化石墨烯納米片的制備54-55
• 3.1.6 細胞的培養(yǎng)及miRNA的提取55
• 3.2 結(jié)果與討論55-65
• 3.2.1 miRNA的可視化檢測原理55-56
• 3.2.2 GO與DHS的納米組裝56-57
• 3.2.3 合成的納米磁珠的電鏡圖57-58
• 3.2.4 三螺旋分子結(jié)構(gòu)的熒光及電泳表征58-59
• 3.2.5 氧化石墨烯納米片(GONPs)對不同類型核酸分子的選擇性吸附59-61
• 3.2.6 實驗條件的優(yōu)化61-63
• 3.2.6.1 Phi 29聚合酶的用量及反應(yīng)時間的優(yōu)化61-62
• 3.2.6.2 三螺旋結(jié)構(gòu)分子-納米磁珠復(fù)合物及氧化石墨烯納米片納米片對細胞的毒性實驗62-63
• 3.2.7 特異性分析63-64
• 3.2.8 miRNAs檢測的靈敏度實驗64-65
• 3.2.9 細胞實驗65
• 3.3 小結(jié)65-66
• 參考文獻66-69
• 第四章 基于靜電吸附的有序核酸分子聚集體對單細胞內(nèi)miRNA的可視化檢測69-88
• 4.1 實驗部分70-74
• 4.1.1 試劑70-72
• 4.1.2 儀器72-73
• 4.1.3 氨基修飾二氧化硅(PCMSNs)的合成73
• 4.1.4 PCMSNs-N1N2探針的制備73
• 4.1.5 ONAAs-PCMSNs的構(gòu)建73-74
• 4.2 結(jié)果與討論74-84
• 4.2.1 單細胞靶miRNA檢測的ONAAs-PCMSNs策略構(gòu)建原理74-75
• 4.2.2 可行性實驗75-76
• 4.2.3 PCMSNs的TEM76-77
• 4.2.4 PCMSNs的氮吸附77-78
• 4.2.5 HCR實驗條件的優(yōu)化78-79
• 4.2.5.1 雜交鏈式反應(yīng)時間的優(yōu)化78
• 4.2.5.2 緩沖液的pH值78
• 4.2.5.3 反應(yīng)溫度的優(yōu)化78-79
• 4.2.6 ONAAs-PCMSNs策略檢測miRNA的靈敏度79-81
• 4.2.7 細胞的培養(yǎng)及miRNA的提取81
• 4.2.8 N1和N2自組裝的氨基介孔二氧化硅的MTT實驗81-82
• 4.2.9 特異性試驗82-83
• 4.2.10 細胞成像83-84
• 4.3 小結(jié)84-85
• 參考文獻85-88
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文88-89
• 致謝89

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本文編號：566195